戊型肝炎病毒ORF3蛋白對(duì)PI-3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié).pdf

1、一、課題的研究目的及意義 戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染引起的急性傳染病,主要流行于亞洲、非洲和中美洲一些發(fā)展中國(guó)家,在墨西哥、印度、巴基斯坦、尼泊爾等國(guó)家已發(fā)生數(shù)次爆發(fā)流行.戊型肝炎病毒感染易發(fā)展成暴發(fā)性肝炎,病死率較高,孕婦戊型肝炎病死率高達(dá)15﹪～25﹪,對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成很大威脅.雖然經(jīng)過(guò)多年探索,但還沒(méi)有成功的HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型和HEV感染小動(dòng)物模型,這對(duì)研究戊型肝炎造成很大障礙

2、.目前對(duì)HEV侵入肝細(xì)胞的機(jī)制,病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況,HEV引起肝臟損傷的機(jī)制,孕婦感染HEV后高病死率的原因都了解甚少,從而為戊型肝炎的防治特別是重型戊型肝炎的治療帶來(lái)很大困難.至今戊型肝炎在臨床上尚無(wú)有效治療方法,重型戊型肝炎病死率相當(dāng)高,進(jìn)一步研究戊型肝炎發(fā)病機(jī)制,可為其治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和藥物靶點(diǎn),在理論和實(shí)踐上均具有重要意義. HEV基因組為線(xiàn)狀單股正鏈RNA,全長(zhǎng)7.2～7.6 kb,包含3個(gè)開(kāi)放讀碼框架(open

3、reading frame,ORF)即ORF1、ORF2、ORF3.其中ORF3位于結(jié)構(gòu)區(qū)的ORF1和ORF2之間,5'端與ORF1重疊1bp,3'端與ORF2重疊328 bp,由369bp組成,起始端含起始密碼子AUG,可獨(dú)立編碼蛋白質(zhì).ORF3蛋白全長(zhǎng)123個(gè)氨基酸(aa),分子量約13.5 kD,目前對(duì)ORF3蛋白的功能了解甚少,體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,不同基因型HEV ORF3蛋白可與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合,初步研究提示其可能與宿主細(xì)胞

4、信號(hào)蛋白發(fā)生相互作用.當(dāng)前信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常同人類(lèi)疾病的關(guān)系是生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域.越來(lái)越多的證據(jù)表明,病毒致病即源于病毒蛋白所致宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的紊亂,其通過(guò)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)的相互作用而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的生物活性,進(jìn)而激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),改變宿主細(xì)胞的生物學(xué)特性,在病毒致病中發(fā)揮重要作用. 我們提出HEV ORF3蛋白通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為病毒在體內(nèi)復(fù)制及致病的分子機(jī)制之

5、一.本課題通過(guò)構(gòu)建HEV ORF3真核表達(dá)載體pcHEV3,然后將pcHEV3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞表達(dá)ORF3蛋白,檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)PI-3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,初步揭示HEV感染所致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與HEV致病性的關(guān)系,為防治戊型肝炎提供新的理論基礎(chǔ)和思路. 二、研究方法 1.從實(shí)驗(yàn)感染戊型肝炎病毒新疆株的獼猴膽汁中用Trizol試劑提取HEVRNA; 2. 以獼猴膽汁中提取的HEV RNA為模板,用逆

6、轉(zhuǎn)錄法合成HEV cDNA; 3.根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的我國(guó)HEV新疆株eDNA序列,分別設(shè)計(jì)與ORF3 5'端和3'端序列相互補(bǔ)的引物.在其5'端引入Ecog I酶切位點(diǎn),3'端引入.Xho I酶切位點(diǎn).使用PCR.方法擴(kuò)增HEV ORF3 cDNA片段,PCR反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確定是否擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度HEV ORF3 eDNA片段; 4.用QIAquick Gel Extraction kit從電泳后的瓊脂糖凝

7、膠中回收HEV ORF3eDNA片段: 5.用EcoR I/Xho I雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3和HEVORF3 eDNA片段,pcDNA3酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確證pcDNA3完全線(xiàn)性化,剩余酶切產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction Kit回收; 6.用T4 DNA連接酶連接pcDNA3酶切產(chǎn)物和HEV ORF3 cDNA酶切產(chǎn)物,構(gòu)建HEV ORF3蛋白真核表達(dá)重組載體pcHEV3;

8、 7.用重組載體pcHEV3轉(zhuǎn)化大腸桿菌,將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌轉(zhuǎn)種到含氨芐青霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)平板上,經(jīng)氨芐青霉素抗性初步篩選后,挑取單個(gè)菌落增菌培養(yǎng); 8.用堿裂解法提取質(zhì)粒pcHEV3,EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察ORF3 cDNA是否插入到了pcDNA3載體中; 9.將插入HEV ORF3 cDNA的重組質(zhì)粒pcHEV3進(jìn)行DNA測(cè)序,鑒定重組質(zhì)粒中ORF3 cDNA序列的完整性及正確性;

9、 10.將重組質(zhì)粒pcHEV3用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,細(xì)胞分為4組:第1組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcHEV3;第2組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3;第3組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcHEV3(預(yù)先加入PI-3K抑制劑LY294002);第4組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒; 11.將pcHEV3轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞,48 h后固定,用間接免疫熒光法原位檢測(cè)ORF3蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位; 12.將pcHEV3轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞,48 h后用1﹪NP-40細(xì)胞裂解緩

10、沖液裂解細(xì)胞,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt; 13.將pcHEV3轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞,48 h后用低滲緩沖液裂解細(xì)胞,提取和制備核蛋白,電泳遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位及活化. 三、結(jié)論 1.HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcHEV3后,能表達(dá)ORF3蛋白,且ORF3蛋白主要分布在細(xì)胞漿中,可以作為研究病毒蛋白與宿主細(xì)胞相互作用的有效工具和方法: 2.HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒表達(dá)H

11、EV ORF3蛋白后,蛋白激酶Akt發(fā)生磷酸化而激活,且Akt的激活依賴(lài)于PI-3K的活化; 3.HEV ORF3蛋白可通過(guò)PI-3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NF-кB,使其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,NF-кB調(diào)控的眾多基因產(chǎn)物在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,提示戊型肝炎病毒感染人體后的肝細(xì)胞損傷可能與NF-кB活化后的炎癥反應(yīng)有關(guān); 4.PI-3K抑制劑LY294002可阻斷HEV ORF3蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)PI-3