氣虛致瘀證本質(zhì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表征及分子基礎(chǔ)初探.pdf

1、目的：本課題擬采用傳統(tǒng)氣虛致瘀動物模型，通過對氣虛致瘀發(fā)展過程中動態(tài)基因表達(dá)譜的差異分析和比較研究，揭示氣虛血瘀證的動態(tài)演變過程及其規(guī)律的分子基礎(chǔ)；通過對證相關(guān)基因(群)功能的調(diào)控研究，初步闡明“芪歸藥對”益氣活血效應(yīng)的分子機理；同時，從“以藥測證”的認(rèn)識論角度反證氣虛致瘀分子基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)的合理性和科學(xué)性。 方法： 1.采用饑餓、過勞和寒涼復(fù)合因素復(fù)制大鼠氣虛血瘀模型。實驗周期4周。 2.觀察氣虛血瘀發(fā)展中模型動物表

2、征變化。動態(tài)監(jiān)測氣虛血瘀模型大鼠5、14、28天時的血液流變性、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、T細(xì)胞亞型計數(shù)、腎上腺重量和腎上腺指數(shù)。 3.全基因組芯片研究對照組大鼠和模型組大鼠5、14、28天時外周血細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。采用GeneOnology、GenMAPP2.1軟件對比分析實驗各時相點免疫功能差異表達(dá)基因生物學(xué)功能和信號通路。 4.將SD大鼠分為對照組、氣虛血瘀模型組、“芪歸藥對”高、中、低劑量組和黃芪組，造模方法同前。各劑

3、量藥對組分別灌胃給予相當(dāng)于生藥24、12、6g/kg體重的黃芪當(dāng)歸(5:1)水煎液，黃芪組灌胃給予相當(dāng)于生藥20g/kg體重的黃芪水煎液。 5.動態(tài)監(jiān)測“芪歸藥對”、黃芪組對氣虛血瘀大鼠表征、血液流變性、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和T細(xì)胞亞型計數(shù)、腎上腺重量的影響。 6.采用實時熒光定量PCR檢測實驗5、14、28天時，“芪歸藥對”、黃芪對氣虛血瘀大鼠外周血細(xì)胞IL-1β、TNF-α、HSP-70、NF-κB、p38MAPK和JNK

4、六種因子mRNA的表達(dá)。 7.觀察“芪歸藥對”、黃芪對氣虛血瘀大鼠胸主動脈病理變化的影響。 8.采用實時熒光定量PCR檢測實驗28天時，”芪歸藥對”、黃芪對氣虛血瘀大鼠胸主動脈組織中IL-1β、FNF-α、HSP-70、NF-κB、p38MAPK和JNKmRNA表達(dá)的影響；采用westernblottjng檢測“芪歸藥對”、黃芪對氣虛血瘀大鼠胸主動脈組織中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：

5、 1.模型動物表征與氣虛血瘀臨床表現(xiàn)一致。 2.模型組大鼠全血粘度高切、中切與對照組相比無顯著差異，全血粘度低切、全血還原粘度升高，28天時與對照組比較非常顯著的升高(P＜0.01)，纖維蛋白原含量、血漿粘度升高，在14天、28天時與對照組相比明顯增多(P＜0.05或P＜0.01)；模型組大鼠RBC計數(shù)、RBC壓積和RBC剛性指數(shù)在實驗進程中均無明顯變化，RBC聚集指數(shù)在5天與對照組比較有顯著性的升高(P＜0.05)，2

6、8天時有非常顯著的升高(P＜0.01)；RBC電泳時間延長，在14天、28天時與對照組比較差異顯著或非常顯著(P＜0.05或P＜0.01)。 3.模型組大鼠CD4+T細(xì)胞計數(shù)減少，28天時與對照組相比差異顯著(P＜0.05)；CD8+T、CD3+T細(xì)胞計數(shù)在5天時與對照組比較明顯減少(P＜0.05)，14、28天時與對照組相比減少的更為顯著(P＜0.01)。 4.模型組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞3H-TdR摻入量下降，與對照組

7、相比有非常顯著的差異(P＜0.01)。 5.對照組大鼠腎上腺重量在實驗中一直增加，模型組大鼠腎上腺重量與對照組相比在第5天時有顯著升高(P＜0.05)，14天時與正常組接近，28天顯著低于正常組(P＜0.05)。對照組大鼠腎上腺指數(shù)在實驗中無明顯改變，模型組大鼠腎上腺指數(shù)隨造模時間延長顯著或非常顯著的增加(P＜0.05或0.01)。與對照組比較非常顯著的增加(P＜0.01)。 6.大鼠全基因組芯片結(jié)果顯示差異表達(dá)基因生物

8、學(xué)途徑分類集中在細(xì)胞過程、代謝過程，生物調(diào)節(jié)；細(xì)胞組件分類主要集中在細(xì)胞組件、細(xì)胞器細(xì)胞器組件和大分子復(fù)合物；分子功能分類主要是結(jié)合分子、催化活性、酶調(diào)活性。實驗14天時差異表達(dá)的基因數(shù)目最多。 7.與免疫功能相關(guān)的差異表達(dá)基因共有212個，免疫功能差異表達(dá)基因主要與免疫應(yīng)答相關(guān)，免疫應(yīng)答差異表達(dá)基因參與眾多免疫過程，如免疫效應(yīng)過程、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答等。GenMAPP信號通路分析細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)通路變化最明顯。

9、 8.與模型組比較，“芪歸藥對”高劑量組大鼠體重28天時非常顯著的增加(P＜0.01)；大鼠游泳時間延長(P＜0.05)；與模型組比較28天時舌象評分非常顯著的下降(P＜0.01)；低切全血粘度、全血還原粘度、纖維蛋白原含量下降，與模型組比較28天時差異顯著(P＜0.05)；血漿粘度14天時開始非常顯著的下降(P＜0.01)；RBC聚集指數(shù)與一直顯著下降(P＜0.05)，RBC電泳時間縮短，5天、14天與模型組比較差異顯著(P＜0.

10、05)，28天差異非常顯著(P＜0.01)；CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P＜0.05)；外周血T淋巴細(xì)胞3H-TdR摻入量非常顯著或顯著性升高(P＜0.01或P＜0.05)；腎上腺重量5天時非常顯著的下降(P＜0.01)。、大鼠體重、游泳時間、舌象評分與模型組比較均無明顯差異。 9.與模型組比較，黃芪組大鼠RBC電泳時間縮短，5天、28天與模型組比較差異顯著(P＜0.05)；外周血T淋巴細(xì)胞3H-TdR摻入量14和28天時顯著增

11、加(P＜0.05)。 10.與模型組比較，“芪歸藥對”中、低劑量組大鼠體重、游泳時間、血液流變學(xué)、T細(xì)胞亞群計數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腎上腺重量均無顯著差異。 11.與對照組比較，模型組大鼠外周血細(xì)胞中IL-1β，HSP-70，NF-κB，p38MAPK和JNKmRNA表達(dá)較對照組顯著升高(P＜0.05或0.01)，F(xiàn)NF-αmRNA表達(dá)在5、14天時較對照組非常顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，“芪歸藥對”高劑量組IL

12、-1β，JNKmRNA表達(dá)非常顯著下降(P＜0.01)；FNF-αmRNA表達(dá)在5、14天時非常顯著降低(P＜0.01)；NF-κBmRNA表達(dá)28天時非常顯著下降(P＜0.01)；HSP-70，p38MAPKmRNA表達(dá)在14、28天時非常顯著下降(P＜0.01)。黃芪組與模型組比較，IL-1β，JNKmRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05或0.01)；TNF-αmRNA表達(dá)在5、14天時下降(P＜0.05或0.01)；HSP-70，NF

13、-κBmRNA表達(dá)28天時非常顯著下降(P＜0.01)；p38MAPKmRNA表達(dá)在14、28天時顯著下降(P＜0.05)。與黃芪組比較，“芪歸藥對”高劑量組IL-1β，JNKmRNA表達(dá)14天時顯著下降(P＜0.05或0.01)。 12.模型組動脈內(nèi)皮細(xì)胞有脫落，內(nèi)膜明顯增厚，中膜結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌層明顯增生；“芪歸藥對”組動脈內(nèi)膜增生較模型組明顯減輕，趨于正常動脈，黃芪組動脈內(nèi)膜增生較模型組減輕但不明顯，可見少量內(nèi)皮細(xì)胞脫落。

14、 13.氣虛血瘀大鼠動脈組織中TNFα、IL1、NF-κB、p38MAPK和JNKmRNA的表達(dá)均顯著升高，與對照組差異非常顯著(P＜0.01)，HSP-70mRNA表達(dá)無變化。黃芪組、“芪歸藥對”組顯著或非常顯著降低TNFα、IL1、NF-κB、p38和JNKmRNA(P＜0.05或0.01)的表達(dá)，對HSP-70mRNA表達(dá)無影響。與黃芪組比較，“芪歸藥對”高劑量組IL-1和JNKmRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05或P＜0.

15、01)。 14.模型組大鼠動脈組織中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表達(dá)非常顯著的升高(P＜0.01)；“芪歸藥對”高劑量組大鼠動脈組織中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表達(dá)減少，(P＜0.01)；黃芪組大鼠動脈組織中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表達(dá)減少，與模型組相比差異顯著(P＜0.05)；“芪歸藥對”降低NF-κB/p65、p-c-jun蛋白表達(dá)的能力更強，與黃芪組比較差異非常顯著或顯著(P＜0.01或

16、P＜0.05)。 結(jié)論： 1.長期饑餓、過勞、寒涼導(dǎo)致大鼠氣虛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表征為毛色枯槁、體重下降、運動能力減低；隨后出現(xiàn)舌象紫黯、鼠尾紺涼以及粘(全血粘度低切、全血還原粘度、血漿粘度的升高)、凝(纖維蛋白原含量增加)、聚(紅細(xì)胞電泳時間延長、紅細(xì)胞聚集指數(shù)增加)的血液流變學(xué)特點。 2.氣虛血瘀證動態(tài)演變過程中始終存在以T細(xì)胞數(shù)量、T細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以及HPA軸免疫調(diào)節(jié)功能異常為主的免疫功能失衡。 3.氣虛致瘀

17、證發(fā)展過程中涉及不同的生物學(xué)功能。氣虛血瘀證是功能基因群而非單一基因的異常表達(dá)。 4.淋巴細(xì)胞、補體、細(xì)胞因子等眾多的免疫功能基因參與了氣虛致瘀證的發(fā)展、變化，共同調(diào)控了免疫系統(tǒng)功能。 5.“芪歸藥對”有效改善氣虛血瘀模型動物表征和粘、凝、聚的血流狀態(tài)；明顯促進T細(xì)胞和腎上腺功能。 6.“芪歸藥對”通過抑制NF-κB、p38MAPK和JNK多條免疫應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而調(diào)節(jié)IL-1β，TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)來