6-羥多巴胺誘導(dǎo)的去交感神經(jīng)支配對大鼠骨代謝的影響.pdf

1、骨結(jié)構(gòu)在人的一生中不停的改建并接受各種系統(tǒng)性和局部性因子的調(diào)節(jié)。最近的組織化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)參與骨代謝的調(diào)控，其調(diào)控由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞來媒介的，同時發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞胞膜上有多種腎上腺素受體和神經(jīng)肽受體，表明外周交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元通過與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的突觸接觸來動態(tài)的局部調(diào)控骨的代謝。目前大量的離體和活體實驗已經(jīng)證實交感神經(jīng)系統(tǒng)參與骨代謝的調(diào)控，交感神經(jīng)系統(tǒng)可以通過對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)而間接影響到骨組織代謝

2、。近期的研究表明交感神經(jīng)及外周感覺神經(jīng)軸突向成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞延伸是受到局部骨代謝的動態(tài)神經(jīng)調(diào)節(jié)。骨膜受到有髓鞘與無髓鞘的感覺神經(jīng)纖維支配。這兩種神經(jīng)纖維均能釋放出降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）與P物質(zhì)（SP）。而降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）與P物質(zhì)（SP）已經(jīng)被證實直接和/或間接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞[1-7]。而交感神經(jīng)對骨代謝影響的機制尚未完全闡明。
　　6-羥多巴胺是一種常被用來選擇性地殺死多巴胺和去甲腎上腺素神經(jīng)元的一種神

3、經(jīng)毒素。作為一種神經(jīng)毒劑，6-羥多巴胺可以選擇性破壞交感神經(jīng)末梢。同時，在外周應(yīng)用時不經(jīng)過血腦屏障，并破壞外周交感神經(jīng)軸索纖維，是目前一種公認(rèn)的交感神經(jīng)化學(xué)切除劑[8-9]。
　　在本研究中，我們采用了三種不同劑量的6-羥多巴胺來選擇性的破壞成年大鼠的交感神經(jīng)纖維，通過μCT掃描觀察骨量和結(jié)構(gòu)的變化，采用RT-PCR技術(shù)檢測mRNA表達水平，采用生物材料力學(xué)指標(biāo)檢測骨強度的變化，血漿生化學(xué)ELISA分析骨細(xì)胞代謝活性標(biāo)記物含量的變

4、化以及組織學(xué)檢查來觀6-羥多巴胺誘導(dǎo)的交感神經(jīng)切除對骨代謝的影響。
　　材料方法
　　32只8周齡雄性Wistar大鼠被隨機分成4組，對照組和三種不同劑量6-羥多巴胺治療組（100mg/kg，200mg/kg和300mg/kg），每組8只，6-羥多巴胺和溶劑（對照組）連續(xù)5天在大鼠腹腔內(nèi)注射，4周后所有動物經(jīng)腹動脈放血處死，處死前13天和3天前分別腹腔注射四環(huán)素和鈣黃素。脛骨、股骨、第6腰椎和血漿標(biāo)本取材。
　　右側(cè)脛

5、骨的近中骨骺端行μCT掃描，在圖形工作站上去除皮質(zhì)骨的影像，進行海綿狀骨三維結(jié)構(gòu)重建，計算出相對海綿狀骨骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。右側(cè)脛骨的近中骨骺端標(biāo)本μCT掃描后脫水，樹脂包埋，制作不脫鈣組織切片，在熒光顯微鏡下觀察，測量四環(huán)素和鈣黃素?zé)晒鈳У拈g距，計算骨礦化沉積率[mineralappositionalrate，MAR(μm/d)]。
　　左側(cè)股骨

6、和第6腰椎椎體分別進行三點彎曲和壓縮實驗，計算骨的生物材料力學(xué)參數(shù)。左側(cè)股骨和第6腰椎取材后-20℃生理鹽水保存，解凍后，分離第6腰椎椎體并磨除兩端骨質(zhì)形成柱狀體結(jié)構(gòu)，使用電腦控制的材料力學(xué)分析儀進行第6腰椎椎體壓縮實驗，椎體置于載物臺上，連接傳感器的壓縮桿以1mm/分的速度壓迫椎體直至變形；股骨至于間距20mm的兩金屬桿頂端，進行三點彎曲實驗，壓縮桿以10mm/分壓迫股骨中段部直至折斷。計算機自動記錄壓力-撓度曲線，得出骨的四個生物材

7、料力學(xué)參數(shù)：強度、延展性、韌性和彈性模量。
　　從右側(cè)股骨近中骨骺端提取mRNA，并使用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基(LigandofreceptoractivatorofNFκB，RANKL)、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達，進行定量分析。RANKL、OPG是成骨細(xì)胞正常的分泌分子，RANKL主要作用是刺激破骨細(xì)胞的分化，增強成熟破骨細(xì)胞的活性并且抑制其凋亡，OPG作為RANKL的

8、誘騙受體競爭性抑制RANKL的作用，從而抑制破骨細(xì)胞的形成和功能。RANKL/OPG的相對水平是決定破骨細(xì)胞形成及其活性大小的關(guān)鍵因素。
　　應(yīng)用ELISA檢測血漿中的成骨細(xì)胞活性標(biāo)記物骨鈣素（Osteocalcin）和破骨細(xì)胞活性標(biāo)記物抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP5b）的含量。大鼠腹動脈血置于干燥管離心取血漿保存于-80℃冰箱，解凍后，按照大鼠骨鈣素（RatOsteocalcin）ELISA試劑盒和大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b

9、(RatTRAP5b)ELISA試劑盒說明書實驗步驟檢測血漿中骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量。骨鈣素是由成骨細(xì)胞分泌的一種活性多肽，在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起著重要作用，是研究骨代謝的一項新的生化標(biāo)志物。TRAP是破骨細(xì)胞骨吸收中表達并被釋放進入血循環(huán)，TRAP被認(rèn)為是有效測定骨吸收速率的潛在標(biāo)記物。
　　左側(cè)脛骨的近中骨骺端標(biāo)本甲醛固定48h，20％EDTA脫鈣三周，脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片，行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染

10、色，光鏡觀察，組織形態(tài)測定法來測定破骨細(xì)胞數(shù)目(Oc.N/BS)和骨吸收表面積(Oc.S/BS)。
　　結(jié)果
　　μCT掃描結(jié)果顯示大劑量6-羥多巴胺(300mg/kg)組脛骨近心骨骺端海綿骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)明顯增加，骨小梁分離度(Tb.Sp)明顯縮小，BV/TV較對照組增加18.9％(P<0.05)，Tb.Sp減少13％(P<0.05)。
　　第6腰椎椎體壓縮實驗顯示大劑量6-羥多巴胺(300mg/kg)組骨生

11、物材料力學(xué)參數(shù)如強度、延展性和韌性分別較對照組增加19.7％(P<0.01)，28.7％(P<0.05)和40.4％(P<0.05)。股骨三點彎曲實驗結(jié)果顯示各項生物材料力學(xué)參數(shù)在實驗組和對照組之間無顯著差異（P>0.05）。
　　RT-PCR檢測顯示各劑量組與對照組比較骨保護素（OPG）的表達無顯著差異（P>0.05），而大劑量6-羥多巴胺(300mg/kg)組中細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（RANKL）的表達較對照組顯著減少

12、27％(P<0.05)。
　　血漿中骨鈣素（Osteocalcin）的含量各劑量組與對照組之間無顯著差異（P>0.05），在大劑量6-羥多巴胺(300mg/kg)組中抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP5b）的含量與對照組比較顯著減少50.3％(P<0.05)。
　　組織形態(tài)測定法測定中等劑量組（200mg/kg）和大劑量6-羥多巴胺(300mg/kg)組破骨細(xì)胞數(shù)目(Oc.N/BS)較對照組分別顯著減少45％(P<0.01)和

13、70％(P<0.01)；骨吸收表面積(Oc.S/BS)分別顯著減少25％(P<0.01)和37％(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　本實驗結(jié)果顯示6-羥多巴胺誘導(dǎo)的交感神經(jīng)切除可以抑制骨吸收，但對骨生成沒有影響，證實交感神經(jīng)支配參與骨代謝的調(diào)節(jié)。6-羥多巴胺抑制骨吸收的作用主要發(fā)生在大劑量組，小劑量組對骨的代謝無影響，中等劑量組破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收表面積顯著減少但骨量沒有顯著變化。6-羥多巴胺抑制骨吸收可能是通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞數(shù)