雙孔鉀離子通道TREK-1和TREK-2功能性串聯(lián)二聚體載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：雙孔鉀離子通道形成二聚體形式發(fā)揮功能的特性導(dǎo)致針對其研究的任何操作都會(huì)涉及兩個(gè)亞基，給研究帶來諸多不便。本研究旨在探討分別在兩分子雙孔鉀離子通道TREK-1和TREK-2間加入柔性多肽連接構(gòu)建串聯(lián)二聚體載體的可行性。
　　方法：利用PCR技術(shù)在兩個(gè)單體TREK-1分子之間加入柔性多肽連接，構(gòu)建其串聯(lián)二聚體載體(pGH19-tdTREK-1)。將上述載體在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA并顯微注射至非洲爪蟾卵母細(xì)胞，培養(yǎng)24-48小時(shí)后采用

2、雙電極電壓鉗技術(shù)記錄電流。觀察細(xì)胞外鋇離子和不同pH值外液對該串聯(lián)二聚體通道表達(dá)的影響，并與天然二聚體通道的反應(yīng)相比較。用上述方法構(gòu)建TREK-2串聯(lián)二聚體載體(WT-WT)，觀察2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-APB)和胞外酸(pH0)對TREK-2串聯(lián)二聚體載體通道電流的影響。用蛋白印跡法檢測TREK-2和TREK-2串聯(lián)二聚體在爪蟾卵母細(xì)胞和HEK293細(xì)胞的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：串聯(lián)二聚體TdTREK-1可在爪蟾卵母細(xì)胞中高

3、效表達(dá)，該通道形成的電流可被胞外鋇離子抑制，也可被胞外液酸化所抑制，并且該串聯(lián)二聚體通道對這些胞外刺激因素的反應(yīng)程度與天然二聚體相似。TREK-2串聯(lián)二聚體載體的電流和藥理學(xué)特性也與TREK-2天然二聚體相似，且表達(dá)出的蛋白確實(shí)為串聯(lián)的二聚體，該二聚體未被降解為單分子形式。
　　結(jié)論：人為加入柔性多肽連接序列構(gòu)建TREK-1功能性串聯(lián)二聚體和TREK-2功能性串聯(lián)二聚體載體通道并不影響通道的表達(dá)及特性，證明該實(shí)驗(yàn)方案可行。這將為我