SNAREs蛋白和鉀離子通道蛋白參與調(diào)節(jié)大菱鲆免疫應(yīng)答.pdf

1、鰻弧菌是危害我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌。本文采用分子生物學(xué),免疫學(xué)和膜片鉗等技術(shù),研究養(yǎng)殖魚類大菱鲆(scophthalmus maximus),在受到病原菌感染后,snare蛋白和鉀離子通道參與免疫應(yīng)答防御機(jī)制的調(diào)控作用。通過(guò)腹腔注射半致死劑量的鰻弧菌,研究受感染的大菱鲆在感染初期所誘發(fā)的一系列應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)鑒定外周血液白細(xì)胞的吞噬和殺滅鰻弧菌的活性,以及外周血、脾臟和頭腎白細(xì)胞所發(fā)生的呼吸爆發(fā)的活性,血清中細(xì)胞因子一白介素1 β的含

2、量的變化,研究抗鰻弧菌的先天性免疫應(yīng)答防御機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染24hr后,白細(xì)胞吞噬鰻弧菌的百分?jǐn)?shù)從47.25[％]增加到61.18[％],吞噬鰻弧菌的指數(shù)從4.68增加到5.62;殺菌活性從1.26增加到1.73;呼吸爆發(fā)活性od600值從0.07增加到0.2;比較外周血、脾臟和頭腎白細(xì)胞三種組織所發(fā)生的呼吸爆發(fā)的活性發(fā)現(xiàn),脾臟白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性最高,頭腎略高于血液,感染8hr后呼吸爆發(fā)活性平均大于1.7;血清中細(xì)胞因子一白介素1

3、β的0d490值從正常魚對(duì)照的0.0523±0.014增長(zhǎng)到感染24hr的最大值0.47±0.033,感染24 hr后的表達(dá)量大約是未感染對(duì)照的9倍,感染后增加量顯著(p<0.05)。進(jìn)一步證明感染初期先天性免疫應(yīng)答防御在保護(hù)魚體中的重要作用。 snare蛋白是一種參與調(diào)控所有真核生物細(xì)胞分泌和胞吐的膜蛋白。為了測(cè)定snare蛋白是否也參與大菱鲆白細(xì)胞的分泌和胞吐,首先通過(guò)rt-pcr方法鑒定大菱鲆體內(nèi)存在的snare蛋白,設(shè)計(jì)

4、兩種snare蛋白(v-snare,vamp-2和t-snare,snap-25)基因的引物,從外周血白細(xì)胞和腦組織中都克隆出snares蛋白中的vamp-2的cdna,而snap-25的cdna僅從腦組織中克隆出。經(jīng)過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn),大菱鲆的vamp-2基因與多數(shù)哺乳動(dòng)物的vamp-2基因同源性在80[％]以上,而氨基酸序列的同源性在90.6[％]以上;大菱鲆snap-25基因與多數(shù)哺乳動(dòng)物的snap-25基因也在83[％]以上,氨基酸

5、序列的同源性在89[％]以上。結(jié)果表明這兩種snare蛋白在大菱鲆體內(nèi)也是非常保守。為了證明snare蛋白是否參與調(diào)控大菱鲆白細(xì)胞細(xì)胞因子白介素-1 β的分泌,研究分泌調(diào)控蛋白-snares在大菱鲆先天性免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用。通過(guò)rt-pcr,免疫印跡,免疫組化技術(shù)克隆了大菱鲆vamp-2基因,并研究了其在細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1 β分泌中的調(diào)控作用。 證明VAMP-2蛋白存在于大菱鲆外周血白細(xì)胞內(nèi)，其核苷酸序列與斑馬魚和鱸魚的同

6、源性分別為88.2％和93.O％。受鰻弧菌感染后，大菱鲆VAMP-2蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都顯著增加，并且在時(shí)間上和表達(dá)量上與IL-1β分泌一致。以上結(jié)果證明VAMP-2在魚類免疫細(xì)胞因子IL-lβ的分泌和先天性免疫應(yīng)答調(diào)控中的重要作用。淋巴細(xì)胞是直接參與獲得性免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞膜上存在許多離子通道，參與調(diào)控鈣離子動(dòng)態(tài)平衡和信號(hào)傳導(dǎo)。其中鉀離子通道在調(diào)控T淋巴細(xì)胞的鈣離子信號(hào)，淋巴細(xì)胞的分化、增殖、激活免疫應(yīng)答方面起關(guān)鍵作用