Bax通路在mfn2誘導肝癌細胞凋亡過程中作用的研究.pdf

1、目的:增殖抑制基因(HSG)又稱為線粒體融合蛋白基因(mfn2)能夠有效的抑制受損傷血管平滑肌增殖及細胞周期,使細胞停滯于G0/G1期,近來文獻報道m(xù)fn2基因能抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡,本實驗主要探討HSG基因誘導肝癌細胞凋亡、抑制細胞增殖的機制,以及觀察Bax/Bcl-2蛋白家族及其凋亡通路以及線粒體凋亡通路在mfn2誘導肝癌細胞凋亡中的作用。
　　 方法:構建含mfn2 cDNA片段的腺病毒Ad-mfn2以及質粒pE

2、GFP-C2-mfn2和pCDNA3.1⊕-mfn2,體外感染或轉染入肝癌細胞內,并以含有綠色熒光蛋白的腺病毒Ad-GFP以及空白質粒pEGFP-C2、pCDNA3.1⊕為陰性對照組,Western Blot檢測HSG高表達組和對照組細胞內線粒體凋亡通路關鍵蛋白Bax、Bcl-2、p53、caspase-3、caspase-9、PARP、Apaf-1等的差異,流式細胞術檢測肝癌細胞周期及凋亡的變化.分離并提純肝癌細胞線粒體蛋白及胞漿蛋白

3、,Western Blot觀察細胞色素C和Bax在細胞內不同細胞器中含量的變化。構建短發(fā)卡RNA shR-mfn2和shR-bax并共轉染入正常肝細胞L02和肝癌細胞,流式細胞術、DNAladder和CCK-8檢測細胞凋亡和增殖的變化,報告基因方法檢測肝癌細胞高表達mfn2基因后caspase-3活性的變化。
　　 結果:感染Ad-mfn2的mfn2高表達組和轉染pCDNA3.1⊕-mfn2的中表達組凋亡顯著增加(p＜0.01)

4、,較對照組細胞總蛋白內Bax、Bcl-2、p53表達無顯著性差異,但Caspase-3、PARP、Apaf-1蛋白表達顯著增加(p=0.004、p=0.045、p=0.010)。Ad-mfn2轉染培養(yǎng)的HepG2后,細胞周期阻滯在Go/G1期,S期細胞數量顯著減少,而凋亡顯著增加。高表達HSG細胞線粒體蛋白內細胞色素C減少、Bax增加,相對細胞漿內細胞色素C增加、Bax減少,兩者有顯著性差異(細胞色素C:p=0.024 VS p=0.0

5、40;Bax:p=0.018 VS p=0.039)。正常肝細胞shRNA干擾mfn2表達顯著促進細胞增殖,其與干擾bax表達組無顯著性差異(p=0.196)。高表達mfn2組肝癌細胞轉染入shR-bax使細胞凋亡顯著被抑制(p=0.0103)。肝癌細胞高表達mfn2基因后caspase-3活性相對于對照組及空白對照組顯著增加(p＜0.01)。
　　 結論:mfn2基因過表達可以抑制肝癌的生長,促進肝癌細胞的凋亡,mfn2是潛在