周圍型大麻素受體對大鼠骨骼肌挫傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：全身骨骼肌分布廣范,在法醫(yī)學(xué)、運(yùn)動醫(yī)學(xué)和整形醫(yī)學(xué)中骨骼肌挫傷發(fā)生率較高。哺乳動物骨骼肌的再生能力已經(jīng)得到了證實(shí)。骨骼肌損傷輕微,肌膜保持完整,可以通過再生恢復(fù)其收縮力,而損傷嚴(yán)重,傷及肌膜,則肌纖維再生不完全,形成纖維性修復(fù)。纖維性修復(fù)與再生這兩個(gè)過程相互支持、相互制約,共同影響著骨骼肌損傷后恢復(fù)的質(zhì)量。目前研究較多的是骨骼肌損傷后再生過程,但是關(guān)于骨骼肌纖維性修復(fù)研究報(bào)道甚少,所以促使我們尋找一種能夠抑制骨骼肌損傷后纖維化的新指

2、標(biāo)。
　　 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)主要由大麻素受體(cannabinoid receptor,CBR)、內(nèi)源性大麻素(endocannabinoid)和合成與降解內(nèi)源性大麻素的酶組成。CBR分為1型大麻素受體(CB1 receptor,CB1R)和2型大麻素受體(CB2 receptor,CB2R)兩個(gè)亞型。CB2R基因于1993年被克隆,主要分布和表達(dá)于免疫系統(tǒng)組織,包括脾、胸腺以及血源性細(xì)胞,如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,又

3、稱之為周圍型大麻素受體(peripheral cannabinoid receptor)。近年來發(fā)現(xiàn)CB2R還表達(dá)于結(jié)腸粘膜固有層中的巨噬細(xì)胞、骨骼中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及人類和嚙齒類動物的骨骼肌。
　　 CB2R與人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。激活CB2R可以抑制肝損害后纖維化形成,減輕慢性胰腺炎的纖維化程度,而且能夠緩解系統(tǒng)性硬化病中皮膚和肺纖維化的發(fā)展,并且對心肌缺血再灌注損傷后的心肌具有保護(hù)作用

4、。但是CB2R是否參與了骨骼肌挫傷修復(fù)的調(diào)節(jié),目前國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。
　　 本課題在建立了大鼠骨骼肌挫傷動物模型基礎(chǔ)上,并實(shí)施CB2R選擇性激動劑(JWH-133)及拮抗劑(AM630)干預(yù)手段,旨在探討:(1)CB2R表達(dá)和肌成纖維細(xì)胞數(shù)量分別隨損傷時(shí)間規(guī)律性的變化,有可能應(yīng)用于骨骼肌損傷時(shí)間的推斷;(2)骨骼肌挫傷修復(fù)過程中,CB2R通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowth factor-β1,TG

5、F-β1),纖維連接蛋白特殊結(jié)構(gòu)域A(fibronectin extra domainA,FN-EIIIA),alpha平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinases-2,MMP-2)等因子的生物學(xué)功能、以及肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)

6、的生物學(xué)行為,影響骨骼肌挫傷后纖維化程度,揭示內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中的周圍型大麻素受體在骨骼肌挫傷修復(fù)過程中的作用。為探索骨骼肌挫傷修復(fù)的新機(jī)制,進(jìn)一步闡明骨骼肌挫傷纖維性修復(fù)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。為今后在運(yùn)動醫(yī)學(xué)和整形醫(yī)學(xué)中研究肌肉損傷丌辟新的途徑和方法,本研究成果有可能對未來研發(fā)相應(yīng)治療藥物具有重要意義。
　　 材料與方法：
　　 一、大鼠骨骼肌挫傷模型的建立參照Kami等大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型,自制骨骼肌打擊器,打擊器

7、與傳感器相連,通過傳感器檢測出打擊器下落的速度,根據(jù)Ek=1/2mv2,計(jì)算出動能。應(yīng)用2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,右下肢剪毛備皮。并將大鼠右下肢置于伸膝、踝背屈90°位置,用自制打擊器(重500克)打擊大鼠右下肢距跟骨2.5cm處部位。
　　 二、分組及取材健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠65只,體重230g-320g,大鼠以消毒飼料及自來水分籠飼養(yǎng),保持摯料清潔及空氣通暢。
　　

8、 (一)骨骼肌挫傷組及對照組
　　 1、挫傷組分別于挫傷后不同時(shí)間段(3、6、12h、1、3、5、7、10及14d)腹腔注射2％戊巴比妥鈉(350mg/kg)麻醉致死后,取右下肢挫傷區(qū)肌肉,一部分用于石蠟切片的HE染色、Masson三染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色。另一部分用于Western blot和RT-PCR,每個(gè)時(shí)間段5只大鼠。
　　 2、對照組取5只未致傷正常大鼠右下肢相同部位骨骼肌,其余同上。

9、　　 (二)體內(nèi)CB2R激動劑組、拮抗劑組及Vehicle組
　　 1、CB2R激動劑組分別于挫傷時(shí)及傷后1d、3d、5d、7d、9d、11d及13d,于挫傷處肌肉內(nèi)注射CB2R選擇性激動劑JWH-133,按工作液濃度5mg/ml(溶解于DMSO和生理鹽水)給藥50μl,傷后14d處死大鼠,取右下肢挫傷區(qū)肌肉,一部分用于HE染色、Masson染色和免疫組織化學(xué)染色。另一部分用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,共5只大鼠。
　　

10、 2、CB2R拮抗劑組分別于挫傷時(shí)及傷后1d、3d、5d、7d、9d、11d及13d,于挫傷處肌肉內(nèi)注射CB2R選擇性拮抗劑AM630,按工作液濃度5mg/ml(溶解于DMSO和生理鹽水)給藥50μl,傷后14d處死大鼠,其余同上。
　　 3、Vehicle組挫傷處肌肉內(nèi)注射溶解于生理鹽水的DMS050μl,其余同上。
　　 三、組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)染色骨骼肌樣本經(jīng)4％多聚甲醛(pH7.4)固定1d,脫水、透明,包

11、埋在石蠟中,制作5μm切片,進(jìn)行HE染色、Masson三染色、免疫組化染色和免疫熒光染色。
　　 四、Western blot檢測CB2R和GAPDH蛋白提取樣本總蛋白,置于-80℃保存。采用Lowry法和BCA法測蛋白濃度,定總蛋白40μg,進(jìn)行PAGE-SDS凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用5％脫脂奶粉封閉后,分別用兔抗大鼠CB2R多克隆抗體(1:600)、小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜,分

12、別再用相應(yīng)的二抗室溫孵育,ECL發(fā)光,經(jīng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描,用Scion Image軟件檢測蛋白條帶CB2R灰度值與GAPDH灰度值,兩者比值為其相對蛋白定量。
　　 五、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測CB2R和GAPDH mRNA
　　 (一)RNA提取用RNAiso Plus提取組織總RNA。紫外可見光分光光度計(jì)測定OD260/OD280值,并且計(jì)算RNA濃度,將樣品部分RNA稀釋成0.5μg/μl,-

13、80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 (二)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表1,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需試劑和使用量(三)PCR反應(yīng)表2,PCR反應(yīng)所需試劑和使用量(四)電泳6μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物和4μl溴酚蘭混合后,加入2％瓊脂糖凝膠梳孔內(nèi),進(jìn)行穩(wěn)壓電泳,電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃膠拍照。
　　 六、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、Col I、Col III、MMP-1、MMP-2和GAPDH mRNA(一)RNA提取同五

14、(二)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表3,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需試劑和使用量(三)Real-Time PCR反應(yīng)表4,Real-Time PCR反應(yīng)所需試劑和使用量七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以P＜0.05為差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、HE染色和Masson三染色
　　 (一)大鼠骨骼肌挫傷動物模型挫傷后3h～6h,挫傷處骨骼肌局部出血、水腫、變性,可見少量多核粒細(xì)胞(polymo

15、rphonuclear cells,PMNs)。傷后12h～1d,大量的PMNs和圓形的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs)聚集在挫傷區(qū),并且壞死骨骼肌纖維被逐漸吞噬。傷后3d到7d,PMNs逐漸變少,MNCs和紡錘形的成纖維樣細(xì)胞(fibroblasticcells,FBCs)大量出現(xiàn),可見新生血管和膠原形成。同時(shí),新生骨骼肌開始增殖,多個(gè)核呈串珠樣位于肌細(xì)胞中央的多核肌管(multinucleated myot

16、ubes)數(shù)量逐漸增加,多存在于挫傷中心區(qū)。從傷后10d～14d,偶見MNCs,主要是FBCs,纖維化程度進(jìn)一步加重。挫傷區(qū)新生多核肌管多己與損傷周邊區(qū)肌纖維殘存端融合,孤立存在的多核肌管數(shù)量減少。Masson染色顯示傷后5d～14d膠原纖維面積逐漸增加。
　　 (二)大鼠骨骼肌挫傷后局部注射藥物動物模型挫傷后14d,CB2R激動劑組挫傷區(qū)可見大量核位于中央的新生肌管,密集排列,并可見多個(gè)核位于肌細(xì)胞周邊較成熟新生骨骼肌。FBC

17、s數(shù)量比CB2R拮抗劑組和Vehicle組少。CB2R拮抗劑組挫傷區(qū)出現(xiàn)大量FBCs,而新生肌管數(shù)量比CB2R激動劑組和Vehicle組少。Masson染色顯示膠原纖維面積由大到小依次為CB2R拮抗劑組、Vehicle組、CB2R激動劑組。
　　 二、免疫組織化學(xué)染色
　　 (一)大鼠骨骼肌挫傷動物模型CB2R分布于對照組大鼠骨骼肌肌膜、肌漿和血管平滑肌。大鼠骨骼肌挫傷后3h～12h,極少數(shù)PMNs微弱表達(dá)CB2R。傷后

18、12h～3d,大量MNCs顯示了CB2R的陽性反應(yīng)。傷后3d～7d,CB2R表達(dá)于MNCs、FBCs、新生多核肌管和新生血管壁中。傷后10d～14d,仍然可見一些陽性FBCs。
　　 Group I(傷后12h～1d),未見α-SMA陽性肌成纖維細(xì)胞的分布。GroupⅡ(傷后5d～7d),肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。GroupⅢ(傷后10d～14d),肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量達(dá)高峰。
　　 (二)大鼠骨骼肌挫傷后局部注射藥物動

19、物模型與拮抗劑組及Vehicle組相比,大鼠接受JWH-133處理后,挫傷修復(fù)區(qū)出現(xiàn)的α-SMA陽性肌成纖維細(xì)數(shù)量明顯減少。
　　 三、雙重免疫熒光染色為了鑒定巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞表達(dá)CB2R,利用激光共聚焦掃描顯微鏡分別共定位CB2R和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(Macrophage Marker)以及CB2R和α-SMA。對照組大鼠骨骼肌可見少許CB2R和Macrophage Marker雙陽性細(xì)胞,傷后1d,挫傷區(qū)出現(xiàn)大量表達(dá)CB2

20、R和Macrophage Marker細(xì)胞。傷后14d,挫傷修復(fù)區(qū)可見大量CB2R和α-SMA雙陽性細(xì)胞。
　　 四、Western blot檢測對照組大鼠骨骼肌有CB2R陽性條帶。骨骼肌挫傷各組CB2R蛋白表達(dá)強(qiáng)度有一定時(shí)間規(guī)律性。傷后1d,陽性條帶明顯增強(qiáng);傷后5d～7d,達(dá)到高峰;傷后10d,開始下降;到傷后14d,CB2R陽性條帶仍強(qiáng)于正常對照組。
　　 五、RT-PCR檢測對照組大鼠骨骼肌可以檢測出CB2R m

21、RNA。和western blot趨勢相似,傷后7d,CB2R mRNA表達(dá)水平達(dá)到高峰。
　　 六、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測我們檢驗(yàn)JWH-133和AM-630對TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、MMP-1和MMP-2 mRNA表達(dá)的影響。AM-630處理后大鼠的TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、ColⅠ和ColⅢ mRNA含量明顯增高。但是,JWH-133處理后大鼠的MMP-1和M

22、MP-2 mRNA表達(dá)更多。
　　 結(jié)論：
　　 1、肌成纖維細(xì)胞在骨骼肌挫傷區(qū)中出現(xiàn)有一定的時(shí)間規(guī)律性,可以作為一種客觀指標(biāo)用于法醫(yī)學(xué)骨骼肌損傷時(shí)間的推斷,并且參與了骨骼肌挫傷區(qū)內(nèi)膠原沉積,促進(jìn)骨骼肌挫傷后纖維化的進(jìn)程。
　　 2、正常大鼠骨骼肌肌膜、肌漿、血管平滑肌細(xì)胞和固有的巨噬細(xì)胞表達(dá)CB2R。
　　 3、骨骼肌挫傷修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞表達(dá)CB2R。并且,CB2R表達(dá)具有時(shí)間規(guī)律性,可