大鼠骨骼肌挫傷愈合過程中單?；视椭久傅姆植技捌鋵Υ笫蠊趋兰〈靷系淖饔玫难芯?pdf

1、肌肉損傷是最常見的損傷類型之一，在肌肉損傷當中，挫傷和牽拉/撕裂傷最為常見。骨骼肌損傷愈合的過程大致分為以下三個階段:炎癥階段、再生階段和纖維化階段，整個過程以破壞的肌纖維的壞死，炎細胞的浸潤，肌源性細胞的激活、增殖分化和纖維組織形成為特點。侵入的炎癥細胞不僅吞噬壞死的肌肉碎片，而且通過分泌一系列的細胞因子對肌肉的再生和纖維化產(chǎn)生重要影響。但是，肌肉損傷早期炎癥反應程度可能過度，并且會導致水腫，進一步造成缺氧和額外細胞死亡。
　　

2、內源性大麻素系統(tǒng)主要由大麻素受體(cannabinoid receptor)、內源性大麻素(endocannabinoid)以及合成與降解內源性大麻素的酶組成。兩種主要的內源性大麻素，花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯酸甘油酯(2-AG)，以按需方式合成和釋放，并分別被脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和單酰基甘油脂肪酶(MAGL)水解。MAGL最初發(fā)現(xiàn)于脂肪組織中，是一種絲氨酸水解酶，催化脂肪分解的最終步驟，導致游離脂肪酸和甘油的產(chǎn)生

3、。有研究證明MAGL在嚙齒類動物腦中存在于興奮和抑制性神經(jīng)元的突出前神經(jīng)末梢。有報道證明MAGL在某些組織中，例如腦、肝和肺，水解2-AG釋放合成促炎類花生酸，從而提示MAGL在炎癥反應中可能發(fā)揮作用。2009年，Long等人合成了一種強效的高選擇性的MAGL抑制劑，稱為JZL184。JZL184能顯著升高2-AG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織的濃度。隨后，許多研究都發(fā)現(xiàn)了JZL184在具有炎癥過程的疾病中具有保護性作用。在使用大鼠和小鼠的研

4、究中，JZL184通過激活大麻素1/2型受體(CB1/CB2)的方式減輕炎癥性神經(jīng)疼痛。在三硝基苯磺酸誘導的結腸炎和脂多糖誘導的急性肺損傷中，JZL184以同樣的方式減弱炎癥反應。在內源性大麻素系統(tǒng)中，因為MAGL的水解底物2-AG可以激活大麻素受體，所以MAGL可以間接調節(jié)大麻素受體。在惡唑酮誘導的接觸性皮炎中，2-AG或激動CB2受體表現(xiàn)出突出的刺激性作用。在實驗性的結腸炎動物模型中，激活CB1和CB2起到了保護性作用。2-AG可能

5、具有抗纖維化作用，在激活的肝衛(wèi)星細胞中，2-AG能夠誘導細胞死亡。并且在先期研究中，我們也發(fā)現(xiàn)在小鼠皮膚損傷愈合過程中，MAGL表達于中性粒細胞、巨噬細胞和肌成纖維細胞。以上結果提示MAGL可能參與炎癥反應和組織修復過程。
　　目的：
　　本實驗的目的是探究MAGL在骨骼肌損傷愈合過程中的時間依賴性表達和分布狀況，并應用MAGL抑制劑JZL184，評估MAGL在骨骼肌損傷愈合中的作用。
　　方法：
　　一、大鼠骨

6、骼肌挫傷模型的建立
　　參照與Kami、于天水等人的大鼠骨骼肌挫傷模型，自制骨骼肌打擊器，打擊器與傳感器相連，通過傳感器檢測出打擊器下落的速度，根據(jù)E=1/2mv2，計算出動能。應用2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后，右下肢剪毛備皮。并將大鼠右下肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制打擊器（重500克）打擊大鼠右下肢距跟骨2.5cm處部位，并以3m/s的速度垂直打擊。動物以過量麻醉方式處死。處死后，參照與于天水、張書韜等

7、人的取材方式，將腓腸肌完整取下并分為等重的兩部分，一部分用于形態(tài)學評估，另一部分用于分子生物學檢測。
　　二、分組
　　實驗1
　　40只成年雄性SD大鼠（體重280-300克）經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，按照上述方式造成骨骼肌挫傷。分別在傷后1，3，5，7，9，13，17和21天各處死5只大鼠。另外5只大鼠的腓腸肌用作對照。
　　實驗2
　　(1)60只成年雄性SD大鼠（體重280-300克）隨機分為2組

8、，每組30只。JZL184溶于DMSO、Tween-80和生理鹽水以1∶1∶18配比的溶劑。一組在傷后立即腹腔注射JZL184(10mg/kg，2ml/kg)，另一組傷后立即注射等量溶劑。每天注射一次，持續(xù)5天。動物在傷后1，3，5，7，9和14天處死。
　　(2)30只成年雄性SD大鼠（體重280-300克）隨機分為2組，每組15只。其中一組腹腔注射JZL184(10mg/kg，2ml/kg)，另一組注射等量溶劑。以上兩組再進一

9、步分為三組，傷后立即分別腹腔注射（腹腔注射JZL184或其溶劑30分鐘前）AM281(CB1受體拮抗劑，3mg/kg，2ml/kg)，AM630(CB2受體拮抗劑，3mg/kg，2ml/kg)或其溶劑。溶解AM281和AM630的溶劑與溶解JZL184的溶劑相同。動物在傷后3天處死。
　　三、組織病理學和免疫組織化學染色
　　骨骼肌樣本經(jīng)4％多聚甲醛(pH7.4)固定1d，經(jīng)脫水、透明等步驟，包埋于石蠟中，制作5μm切片，進

10、行HE染色、Masson三染色、MAGL、CD68、MPO、α-SMA免疫組化染色以及MAGL/MPO、MAGL/MAC387、MAGL/α-SMA雙重免疫熒光染色。實驗中所用一抗:兔抗MAGL多克隆抗體(1∶200;ab24701，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗髓過氧化酶(MPO)多克隆抗體(1∶500;ab65871，Abcam，Cambridge，UK)、小鼠抗髓過氧化酶(MPO)單克隆抗體(1∶50;sc-2718

11、81，SantaCruz Biotechnology, CA，USA)、小鼠抗Macrophage Marker單克隆抗體(1∶50;sc-66204，Santa Cruz Biotechnology, CA，USA)、小鼠抗CD68單克隆抗體(1∶100;ab31630，Abcam，Cambridge，UK)、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體。
　　四、蛋白提取和免疫印記分析
　　提取樣本總蛋白，上樣量為3

12、0μg，轉印到PVDF膜上后用5％脫脂奶粉或BSA封閉孵育過夜，分別用相應的二抗孵育，ECL顯影，膠片中的蛋白條帶經(jīng)Biolmaging systems采集后進行灰度值測定。目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值作為相對表達量。實驗中所用一抗:兔抗MAGL多克隆抗體(1∶200;ab24701，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗IL-1β多克隆抗體(1∶1000; ab1832p，Chemicon，ON，Canada)、兔

13、抗TNF-α多克隆抗體(1∶1000; ab1837p，Chemicon，ON，Canada)、兔抗IL-6多克隆抗體（1∶500; ab6672，Abcam，Cambridge，UK）、兔抗GAPDH多克隆抗體（1∶1000; ab37168，Abcam，Cambridge，UK）。
　　五、細胞因子和趨化因子分析
　　應用大鼠炎癥芯片(QAR-INF-1-4，RayBiotech，Inc，Norcross，GA，USA)

14、同時檢測炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、MCP-1、IFN-γ以及TNF-α的表達。
　　六、RNA提取和實時熒光定量PCR
　　用RNAiso Plus提取組織總RNA。紫外可見光分光光度計測定OD260/OD280值（范圍1.8-2.0），并且計算RNA濃度，將樣品部分RNA稀釋成0.25μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按PrimeScriptTM RT reage

15、nts Kit說明，進行反轉錄反應。應用Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System，采用標準程序兩步法進行PCR擴增。用ΔΔCT法確定目的mRNA的相對表達量。
　　七、統(tǒng)計學分析
　　用PRISM6.0進行數(shù)據(jù)分析，p＜0.05認為存在統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　一、HE及馬松染色結果
　　在HE切片中可以觀察到出血、水腫和肌肉變性在損傷早期出現(xiàn)。傷后1天，大

16、量多形核細胞（polymorphonuclear cells，PMNs）在挫傷區(qū)域出現(xiàn)。圓形的單個核細胞（round-shaped mononuclear cells，MNCs）也在傷后1天出現(xiàn)，其數(shù)量在傷后3天急劇增多。梭形的成纖維樣細胞（spindle-shaped fibroblastic cells，F(xiàn)BCs）也在傷后3天出現(xiàn)。從傷后5天到9天，可觀察到大量的伴隨新生多核肌管。從傷后13天到21天，一直能在挫傷區(qū)內觀察到FBCs

17、和纖維組織。與溶劑組相比，JZL184組內的樣本中新生肌管顯著減少，而膠原顯著增加。
　　二、免疫組織化學染色結果
　　在正常肌肉樣本內，肌細胞的細胞漿顯示MAGL的弱陽性反應。在挫傷肌肉內，PMNs、MNCs、FBCs和多核肌管均顯示了MAGL的強陽性反應。經(jīng)免疫熒光雙重染色，證明MAGL陽性的PMNs、MNCs和FBCs分別為中性粒細胞、巨噬細胞和肌成纖維細胞。在JZL184組，中性粒細胞和巨噬細胞顯著減少，而肌成纖維細

18、胞顯著增加。與JZL184組相比，AM630預處理組的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤顯著下降。
　　三、大鼠炎癥因子芯片分析結果
　　在JZL184組合溶劑組內，MCP-1和TNF-α的表達隨時間增加而逐漸下降，IL-1β的表達隨時間增加而升高。IL-6的表達在傷后3d到達高峰。與溶劑組相比，JZL184顯著降低了上述因子的表達。
　　四、Western blot和Real-time PCR檢測結果
　　包括正常肌肉在

19、內，所有樣本均可檢測到MAGL表達。MAGL蛋白在傷后5、7、9和13天顯著上升。與溶劑組相比，JZL184組TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達和顯著降低。與JZL184組相比，AM281預處理組的IL-1β蛋白表達，AM630預處理組內TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達顯著上升。AM630單獨應用降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達。MAGL mRNA表達在傷后7天達峰，隨后逐漸下降。Col1a1和Col3a