日本血吸蟲病無創(chuàng)型診斷試劑盒開發(fā)的前期研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，也是我國重點防治的重大疾病之一。血吸蟲病的主要危害在于血吸蟲蟲卵導致的肉芽腫及其組織的纖維化，患者在晚期可出現(xiàn)肝脾腫大、門脈高壓和腹水等嚴重的臨床癥狀，晚期患者會喪失勞動力甚或死亡。因此，血吸蟲病及時診治具有重要的臨床意義。 血吸蟲病診斷常用方法主要有病原學和免疫學方法。由于病原學檢查費時耗力，且漏檢率高，免疫學方法已成為目前現(xiàn)場查病的主要輔助診斷方法，且主要是以檢測血清中特異性抗體

2、的血清學方法，如ELISA、IHA等。但是在血吸蟲病疫區(qū)，反復的有創(chuàng)性采血，當?shù)鼐用竦囊缽男栽絹碓讲?。而唾液作為診斷樣本因其采集簡單方便且無創(chuàng)越來越受到關注。已有研究結果提示研發(fā)以唾液作為檢測樣品的無創(chuàng)性診斷試劑盒是可行的。 目前用于血吸蟲病免疫診斷的抗原主要是血吸蟲粗抗原，但粗抗原制備困難，存在一定的交叉反應，且不易標準化，導致檢測試劑批間質量不穩(wěn)定。近年來，隨著基因重組技術以及生物信息學的日益發(fā)展，可對具有診斷價值抗原的組分

3、及性質進行分析鑒定，再通過重組表達純化，應用于診斷。為此，我們利用感染者唾液中特異性的IgG作為探針，對已構建的日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫進行了免疫學篩選。應用生物信息學分析技術，對陽性克隆的插入片段進行序列分析，從中挑選具有診斷價值的抗原基因進行克隆表達，并對其免疫學特性以及診斷價值進行了初步驗證，為進一步研制無創(chuàng)性血吸蟲病診斷試劑盒提供實驗基礎。 研究目的： 獲取能被日本血吸蟲感染者唾液中特異性抗體所識別的日本血吸蟲

4、抗原基因，并完成基因重組表達以及重組蛋白診斷價值評價，為研制能應用于現(xiàn)場的無創(chuàng)型快速篩查診斷試劑盒奠定研發(fā)基礎。 研究內容和方法： 1.日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學篩選及其陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 1.1利用日本血吸蟲病人唾液篩選日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫，獲得陽性噬菌體，并經兩次復篩，選出強陽性克隆作為候選克隆。 1.2采用多聚酶鏈反應(PCR)技術擴增出候選噬菌體的插入片段，運用直接

5、測序技術測定插入cDNA片段的核苷酸序列，經編輯后的序列通過NCBI(the National Center for Biotechnology Information)數(shù)據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN，BLASTX軟件進行分析。 2.候選基因的表達以及免疫學特性分析 2.1 PCR擴增侯選基因開放讀碼框，克隆到載體pET32a(+)中，并進行誘導表達、純化重組蛋

6、白后對重組蛋白進行質譜鑒定。 2.2以血吸蟲感染者的血清和唾液以及非感染者的血清和唾液作為免疫探針，以重組蛋白作為抗原進行Western blot。 2.3用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備抗血清，以該血清作為探針，對重組蛋白和血吸蟲不同發(fā)育時期的可溶性蛋白進行Western blot。 2.4設計侯選基因的特異性引物，提取日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲的總RNA并反轉錄合成相應的cDNA，采用RT-PCR對候選編碼基因

7、在不同蟲期的相對表達水平進行分析。 3.間接ELISA反應條件優(yōu)化及其診斷價值初步鑒定 3.1以純化融合蛋白為抗原，包被酶聯(lián)免疫反應板，用間接ELISA法檢測日本血吸蟲感染者以及非感染者血清以及唾液。摸索最適抗原包被濃度、最適封閉液和封閉時間、最適血清反應時間、濃度以及反應溫度、最適二抗工作濃度、最適顯色時間條件。 3.2用已優(yōu)化的ELISA檢測體系以及AWAP作為包被抗原對日本血吸蟲感染者、非感染者的血清和唾液

8、進行檢測，評價其敏感性和特異性。 研究結果： 1、日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學篩選以及陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 1.1日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫的免疫學篩選鑒定 以直徑為9cm平板含約近4×102個噬菌斑的密度進行初篩，獲40多個初篩陽性噬菌體。初篩陽性噬菌體再復篩2次，最后挑取持續(xù)強陽性噬菌體21個。15個強陽性噬菌體擴增出特異條帶，但其中8個擴增片段大于500bp。取8個PCR產物送

9、去測序，經Clustalw分析，去除重復序列后，最后得到7條待分析的cDNA序列。 1.2陽性噬菌體插入cDNA片段的序列分析 采用BIASTN和BLASTX與NCBI的GenBank中的已知DNA序列和蛋白質序列進行同源性檢索。結果發(fā)現(xiàn)，在待分析的7條cDNA序列中，與其它物種已知序列同源的序列有2條，未發(fā)現(xiàn)同源序列的有3條，與已知日本血吸蟲序列同源的序列有2條，其中一序列BLASTX分析結果顯示，所推導的氨基酸序列為

10、日本血吸蟲毛蚴相關蛋白，其理論分子量約為13kDa將該基因暫時命名為日本血吸蟲毛蚴相關蛋白(Miracidia associated protein of Schistosoma japonicum，SjMP13)基因。 2、SjMP13基因的表達以及免疫學特性分析 2.1編碼基因的擴增、克隆和重組表達 根據GenBank中AY222893.1的序列信息，設計PCR引物擴增SjMP13的ORF，進而將獲得的目的基

11、因片段定向克隆到pET32a(+)質粒中，經PCR、酶切及測序驗證該目的基因克隆成功。將成功構建的重組子pET32a(+)—SjMP13經IPTG誘導表達，在較寬的溫度范圍和IPTG誘導濃度范圍內都獲得了很好的表達；His親和層析柱純化的重組表達產物(rSjMP13)分子大小為35kDa經質譜鑒定，證明是SjMP13蛋白。 2.2 SjMP13轉錄水平分析 提取日本血吸蟲尾蚴、成蟲以及蟲卵的總RNA并反轉錄合為cDNA，

12、采用RT—PCR對SjMP13編碼基因在不同蟲期的相對表達水平進行分析。實驗結果顯示，SjMP13基因在不同發(fā)育期均有轉錄且轉錄水平相近。 2.3 rSjMP13抗原性以及免疫原性的分析 ①rSjMP13抗原性分析以制備的rSjMP13多抗血清為一抗進行Western blot，結果顯示在日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲粗提抗原均識別到一大小在55-72kDa之間的條帶，但其理論分子量約為13kDa。 ②rSjMP13

13、免疫原性分析純化后的重組蛋白能分別被日本血吸蟲感染者唾液和血清所識別，在35kDa左右處均可見一條明顯的免疫反應帶，而陰性對照血清以及唾液在相應的位置未識別出該蛋白條帶。 3、間接ELISA反應條件優(yōu)化及其診斷價值初步鑒定結果 建立并優(yōu)化ELISA方法，最佳包被濃度為7.5μg/mL，最適封閉條件為5％脫脂牛奶37℃封閉1或1.5h；最適血清反應條件為1:200稀釋37℃溫育90min；酶標二抗1：25000稀釋37℃溫

14、育1h；以TMB顯色2min左右為佳。間接ELISA方法對標準血清以粗抗原為包被抗原檢測敏感性為95％，特異性為85.53％，符合率88.79％；以SjMP13為包被抗原檢測感染者以及非感染者的唾液敏感性為92.5％，特異性為92.11％，符合率為92.24％。 研究結論： 采用免疫學篩選及分子克隆技術，以唾液中特異性IgG為探針從日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫中分離到毛蚴相關蛋白基因(命名為，SjMP13)，并成功構建了該