TLR4激活對于PDLSCs和BMMSCs成骨能力的影響及其機制探討.pdf

1、【背景】
　　牙周炎是一種以牙周附著喪失,牙槽骨吸收為特點的口腔疾病。其發(fā)病率高,是導致成年人失牙的最主要原因。對于牙周炎,目前無論基礎(chǔ)治療還是手術(shù)治療對于已缺損組織的修復效果都仍不理想,無法實現(xiàn)功能性的牙周組織再生。這可能與牙周炎發(fā)病機制復雜、細菌無法徹底清除以及機體的免疫反應(yīng)特質(zhì)對疾病發(fā)生發(fā)展的影響等密切相關(guān)。
　　隨著組織工程醫(yī)學的蓬勃發(fā)展,人們開始嘗試應(yīng)用組織工程的方法修復牙周缺損。種子細胞是影響修復效果的一個重要因

2、素。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一種非常有潛力,可以應(yīng)用于牙周組織再生的細胞。其來源于牙周局部,并且體內(nèi)移植后可以形成牙骨質(zhì)-牙周膜樣的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是功能性牙周再生的重要標志。
　　口腔是有菌環(huán)境,牙周病患者又常常伴隨著易于引起菌斑聚集的各種因素。細菌或其毒性產(chǎn)物的存在可能影響細胞治療的效果。
　　機體識別細菌等微生物及其毒性產(chǎn)物主要依靠Toll樣受體(Tol

3、l-like receptors,TLRs)。TLRs是一類保守的受體家族,目前在人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10種(TLR1-10)TLRs亞型,不同亞型的受體識別不同結(jié)構(gòu)的配體。牙周炎的致病菌主要為革蘭氏陰性菌,革蘭氏陰性菌的主要致病成分為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),也被稱作內(nèi)毒素,是主要由TLR4識別的。
　　間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)可以表達TLRs,并且TLRs激活

4、后能夠影響MSCs的功能。不同來源的MSCs對于TLRs的表達不同,TLRs激活后其生物學特性的改變也不相同。PDLSCs屬于MSCs的一種。關(guān)于PDLSCs上TLRs的表達情況及其激活后對于PDLSCs生物學特性的影響仍未見報道。另外骨髓MSCs(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),作為最具有代表性的系統(tǒng)性MSCs,對其TLRs的表達及其對細胞功能的影響各報道也不盡相同。
　　【

5、目的】
　　探明PDLSCs及BMMSCs上TLRs的表達情況。重點研究TLR4激活后對于兩種細胞生物學特性的影響。尤其關(guān)注兩種細胞成骨能力的變化。試圖闡明引起該變化的相關(guān)信號通路,為臨床上能更好的應(yīng)用兩種細胞,趨利避害,提供理論依據(jù)。同時也為牙周炎發(fā)病機制的研究提供相關(guān)線索。
　　【方法】
　　1)體外分離培養(yǎng)PDLSCs及BMMSCs,鑒定兩種細胞的表面標志;real-time PCR檢測兩種細胞mRNA水平TLR

6、1-TLR10的表達。Western Blot檢測蛋白水平TLR4的表達。應(yīng)用LPS刺激兩種細胞,檢測NF-κB通路的變化。2)應(yīng)用LPS體外刺激兩種細胞,cck-8法檢測其增殖能力變化;劃痕試驗檢測其遷移能力變化;成骨成脂誘導后,real-time PCR檢測兩種細胞關(guān)鍵性成骨(ALP,Runx2和SP7)及成脂(LPL,PPARγ)基因變化;輔助以ALP染色檢測成骨誘導后ALP活性變化。茜素紅、油紅O染色及定量檢測兩種細胞最終分化能

7、力改變;將兩種細胞和激活后的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)共培養(yǎng),通過增殖試驗和凋亡試驗檢測兩種細胞免疫調(diào)節(jié)能力變化。3)在LPS刺激的同時,加入TLR4抗體,阻斷TLR4作用,觀察對于兩種細胞成骨能力的影響。4)在加入LPS刺激,NF-κB通路被激活的情況下,加入NF-κB通路阻斷劑PDTC（Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)

8、,阻斷NF-κB通路,觀察對于兩種細胞成骨能力的影響。5)檢測LPS刺激下兩種細胞Wnt/β-catenin信號通路的變化;在LPS刺激的同時,加入Wnt/β-catenin通路的阻斷劑DKK-1(Dickkopf1),觀察其對于兩種細胞成骨能力的影響。6)在SD大鼠口內(nèi)利用LPS牙齦局部注射制造牙周炎模型,通過TLR4抗體或NF-κB通路阻斷劑PDTC進行干預,MicroCT觀察各組大鼠牙周骨缺損情況。對各組組織進行石蠟包埋,切片,A

9、LP及Trap染色,利用軟件定量分析染色結(jié)果,以研究阻斷TLR4或NF-κB通路后對牙周炎發(fā)生發(fā)展的影響。
　　【結(jié)果】
　　1)體外分離培養(yǎng)的PDLSCs及BMMSCs陽性表達Stro-1,CD44,CD146,CD90,CD105,CD29;陰性表達CD31,CD45。在基因水平除TLR7外,兩種細胞均不同程度的表達各種TLRs。在PDLSCs中TLR3表現(xiàn)出了較強的表達,而TLR4的表達量則要弱于BMMSCs中TLR4

10、的表達;在蛋白水平兩種細胞均表達TLR4;經(jīng)過TLR4的配體LPS刺激后兩種細胞的NF-κB通路均被激活。2)LPS刺激后兩種細胞的增殖能力增強,遷移能力減弱;兩種細胞的成脂相關(guān)基因表達增高,成脂能力增強;PDLSCs的ALP染色減弱,成骨相關(guān)基因表達降低,成骨能力減弱;BMMSCs的ALP染色雖然減弱,ALP基因表達明顯降低,但SP7(又名Osterix)有增多趨勢,最終茜素紅定量顯示成骨能力無明顯改變。共培養(yǎng)試驗中,LPS刺激兩種

11、MSCs后,PBMNC的增殖及凋亡均無明顯改變。3)TLR4抗體阻斷后,可以較大程度上逆轉(zhuǎn)LPS刺激下的PDLSCs的成骨能力,而對LPS刺激下的BMMSCs的成骨能力無明顯影響。4)NF-κB通路阻斷后可以一定程度上逆轉(zhuǎn)LPS刺激下的PDLSCs的成骨能力,對 LPS刺激下的BMMSCs成骨能力無明顯影響。5)LPS刺激下,兩種細胞的Wnt/β-catenin通路都被明顯激活。當加入Wnt/β-catenin通路阻斷劑DKK-1后,L

12、PS刺激下的PDLSCs的成骨能力得到了明顯的逆轉(zhuǎn),而對LPS刺激下的BMMSCs成骨能力無明顯影響。6)MicroCT結(jié)果顯示LPS局部牙齦注射能夠在大鼠口內(nèi)造成明顯的牙周缺損,LPS+anti-TLR4組和LPS+PDTC組的骨缺損程度明顯減輕,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),ALP染色結(jié)果顯示TLR4中和抗體或者PDTC能顯著提高牙周膜組織的成骨能力,Trap染色顯示各組的破骨細胞數(shù)量無明顯差異。
　　【結(jié)論】
　

13、　1) PDLSCs及BMMSCs都表達有活性的TLR4。PDLSCs和BMMSCs不同程度的表達各種TLRs亞型,其中TLR4的表達在蛋白水平得到了驗證,并且LPS刺激可使NF-κB通路活化。
　　2) TLR4激活后能夠改變PDLSCs及BMMSCs的生物學特性。TLR4激活可以促進兩者增殖,減弱兩者遷移;對 PDLSCs可減弱其成骨能力促進其成脂能力;對BMMSCs可促進其成脂而對其成骨影響不大;TLR4對兩者的免疫調(diào)節(jié)能力

14、都沒有明顯影響。
　　3)抗體阻斷 TLR4后可以部分逆轉(zhuǎn) LPS刺激下的PDLSCs成骨能力。細胞通過TLR4感受LPS激活,本試驗進一步證明了這一點。但在成骨分化的長期過程中,抗體不能達到100％的阻斷作用。
　　4) TLR4激活后引起的NF-κB通路活化參與了LPS所引起的減弱PDLSCs成骨能力的過程。應(yīng)用NF-κB阻斷劑后可以部分的逆轉(zhuǎn)PDLSCs的成骨能力。
　　5) TLR4激活能夠引起Wnt/β-ca

15、tenin通路活化,后者參與了減弱PDLSCs成骨分化的過程。LPS刺激后 Wnt/β-catenin通路明顯激活。當加入 Wnt/β-catenin阻斷劑DKK1后,LPS刺激下減弱的PDLSCs的成骨能力可以得到部分的恢復。
　　6)在大鼠體內(nèi),阻斷TLR4或NF-κB通路能夠有效地減少LPS所造成的牙周缺損。LPS在大鼠體內(nèi)造成的牙周骨缺損能夠通過阻斷TLR4或NF-κB部分逆轉(zhuǎn),同時又由于ALP染色結(jié)果顯示牙周組織成骨能力