纖溶酶原激活抑制物-1對急性肺損傷小鼠TLR4信號途徑的影響.pdf

1、第一部分PAI-1基因敲除小鼠急性肺損傷模型的特點(diǎn)
　　背景:
　　肺泡及肺血管內(nèi)纖維蛋白沉積是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)的特征性病理改變之一。導(dǎo)致纖維蛋白沉積的因素眾多,其中局部組織因子介導(dǎo)的凝血酶形成和纖溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)表達(dá)上調(diào)所致的纖溶抑制起重要作用。實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn),ALI/ARDS時(shí)肺泡灌洗液(BALF)及血漿PAI-1水平均明顯增加。BALF中PAI-1水平升高與疾病不

2、良預(yù)后密切相關(guān),但是臨床應(yīng)用抗凝藥物并不能改變疾病的進(jìn)程與預(yù)后。提示,PAI-1不僅僅參與了ALI/ARDS的凝血/纖溶過程,可能還有其它更重要的作用。因此,研究PAI-1在ALI/ARDS發(fā)病中的作用及機(jī)制有重要意義。
　　目的:
　　研究PAI-1基因敲除對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠ALI模型的影響。
　　方法:
　　通過氣管內(nèi)滴注LPS(5mg/kg)建立ALI模型。根據(jù)LPS用藥時(shí)間,即用藥前(Oh)、用

3、藥后2h、用藥后4h、用藥后8h,將PAI-1基因敲除(KO)小鼠與野生型(WT)C57BL/6J小鼠均隨機(jī)分為四組,稱為0h組(WT0h組,KO0h組),2h組(WT2h組,KO2h組),4h組(WT4h組,KO4h組)與8h組(WT8h組,KO8h組)。測定各時(shí)間點(diǎn)的肺組織濕/干重比(W/D)、丙二醛含量(MDA)、肺微血管通透性、凝血/纖溶功能及肺組織病理評分。
　　結(jié)果:
　　1.KO組小鼠較WT組的小鼠的病死率明顯

4、升高(40％vs.10％,P＜0.05)。
　　2.KO8h組小鼠的肺損傷評分為11.1±0.6,較WT8h組小鼠的8.5±0.5明顯升高,P＜0.05。
　　3.KO4h組小鼠肺微血管通透性為78.63±7.82、KO8h組小鼠為98.02±10.21,與同一時(shí)間點(diǎn)的WT4h組的62.28±8.62及WT8h組小鼠的81.02±11.35相比明顯增加,P＜0.05。
　　4.LPS刺激后2h,肺組織濕/干重比即有升高

5、趨勢。KO8h組小鼠的W/D為6.36±0.23,顯著高于WT8h組的5.48±0.45,P＜0.05。
　　5.同一時(shí)間點(diǎn)的KO小鼠與WT小鼠肺MDA結(jié)果相似,P＞0.05。
　　6.LPS刺激后,同一時(shí)間點(diǎn)的KO組小鼠與WT組小鼠的各項(xiàng)凝血/纖溶指標(biāo)皆明顯異常,但程度相似,P＞0.05。
　　結(jié)論:
　　1.LPS誘導(dǎo)的ALI模型中,PAI-1基因敲除小鼠的肺部炎癥反應(yīng)較野生型小鼠嚴(yán)重,存活率下降,凝血/纖溶

6、功能改變程度相似。
　　第二部分PAI-1基因敲除急性肺損傷小鼠TLR4信號途徑的變化
　　背景:
　　研究表明PAI-1參與了機(jī)體的炎癥與免疫反應(yīng),但其在肺部的調(diào)控作用存在爭議。Renekens等研究發(fā)現(xiàn),PAI-1基因敲除的肺炎克雷伯肺炎小鼠較野生型的肺炎克雷伯肺炎小鼠病死率增加,細(xì)菌生長負(fù)荷增加;但Rijneveld等有關(guān)肺炎鏈球菌肺炎小鼠模型的研究顯示,PAI-1基因敲除小鼠病死率與細(xì)菌生長負(fù)荷與野生型小鼠相比

7、并無變化。這提示PAI-1在革蘭陰性或陽性細(xì)菌感染過程中,起著不同的作用。其原因可能與兩種類型細(xì)菌的致病特點(diǎn)不同有關(guān),革蘭陰性桿菌主要通過LPS致病,容易發(fā)生ALI。
　　由Toll樣受體(TLRs)途徑啟動(dòng)并級聯(lián)放大的免疫及炎癥反應(yīng),是ALI發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)。TLR4可特異性識(shí)別LPS,LPS的識(shí)別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是宿主對革蘭陰性菌發(fā)生防御反應(yīng)的關(guān)鍵。PAI-1在LPS誘導(dǎo)的ALI中扮演什么角色,是否通過影響TLR4途徑從而影響

8、疾病的進(jìn)程,值得進(jìn)一步探討。
　　目的:
　　研究PAI-1基因敲除對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠TLR4途徑及炎癥介質(zhì)的影響。
　　方法:
　　通過氣管內(nèi)滴注LPS(5mg/kg)建立All模型。根據(jù)LPS用藥時(shí)間,即用藥前(0h)、用藥后8h,將PAI-1基因敲除(KO)小鼠與野生型(WT)C57BL/6J小鼠均隨機(jī)分為二組,稱為0h組(WI0h組,KO0h組)與8h組(WT8h組,KO8h組)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

9、測定各組小鼠BALF、血漿、肺組織炎癥介質(zhì)(IL-6、IL-10及IFN-γ)水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定肺組織IL-6、TLR4、SOCS1與IRAK-M的mRNA表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)法測定肺組織IRAK-M蛋白表達(dá)水平,western-blot法測定IRAK-M、SOCS1及JNK磷酸化、ERK磷酸化蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.與0h組小鼠相比,KO8h組與WT8h組小鼠BAILF中IL-6、IL-10及IFN

10、-γ蛋白水平均明顯增加,P＜0.05。并且,KO8h組小鼠BALF中IL-6、IL-10及IFN-γ水平要明顯高于WT8h組,P＜0.05;在肺組織,KO及WT兩種小鼠的IL-6、IL-10及IFN-γ水平也有上述類似變化;與WT8h組小鼠相比,KO8h組小鼠血漿IL-6、IFN-γ水平均明顯增加,P＜0.05;與0h組小鼠相比,KO8h組與WT8h組小鼠血漿IL-10水平變化不明顯。
　　2.與oh組小鼠相比,KO8h組與WT8

11、h組小鼠肺組織IL-6mRNA水平分別增加3.2倍和1.84倍。與WT8h組小鼠相比,KO8h組小鼠IL-6mRNA水平為2.4倍。
　　3.與0h組小鼠相比,WT8h組小鼠肺組織IRAK-MmRNA、SOCS1mRNA水平明顯增加,而KO8h組小鼠肺組織這兩種基因改變未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與0h組小鼠相比,KO8h組及WT8h組小鼠肺組織TLR4mRNA水平均顯著增加(分別增加4.2倍及27.2倍);KO8h組小鼠TLR4mRNA水

12、平較WT8h組有明顯的增加(6.5倍),P＜0.05。
　　4.免疫組化顯示W(wǎng)T8h組小鼠IRAK-M陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于KO8h組小鼠(IOD3290±358.9vs.1113.4±229.2),P＜0.05。
　　5.Westernblot檢測結(jié)果示KOOh組及WT0h組小鼠肺組織IRAK-M蛋白弱表達(dá),KO8h組及WT8h組小鼠肺組織IRAK-M表達(dá)增加,以WT8h組小鼠增加更明顯(P＜0.05);0h組小鼠SOCS1蛋白

13、均有表達(dá),KO8h組及WT8h組小鼠SOCS1表達(dá)均有增加,但只有WT8h組小鼠SOCS1增加與WT0h組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.Westernblot檢測結(jié)果示KO0h組及WTOh組小鼠沒有或輕微p-JNK、p-ERK表達(dá),KO8h組及WT8h組小鼠有明顯的表達(dá);與WT8h組小鼠相比,KO8h組小鼠p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)增加明顯,P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1.PAI-1基因敲

14、除的ALI小鼠與野生型ALI小鼠相比,TLR4表達(dá)增加,而TLR4負(fù)性調(diào)節(jié)因子如IRAK-M、SOCS1表達(dá)受抑制;同時(shí)伴BALF、血漿及肺組織炎癥因子表達(dá)增加(以IL-6、IFN-γ更明顯),JNK、ERK磷酸化更明顯:
　　第三部分肝素及尿激酶對PAI-1基因敲除急性肺損傷小鼠TLR4和凝血功能的影響
　　背景:
　　研究發(fā)現(xiàn),ALI/ARDS患者BALF的PAI-1水平增加,提示ARDS時(shí)肺臟處于一種促凝環(huán)境。B

15、ALF中PAI-1水平升高與ALI/ARDS的不良預(yù)后密切相關(guān),說明PAI-1的變化是影響ALI/ARDS的重要因素。同時(shí)這也提示,抗凝治療可能會(huì)改善ALI/ARDS的預(yù)后。
　　肝素和尿激酶是臨床上廣泛應(yīng)用的抗凝藥,用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治療及體外抗凝等。目前肝素及尿激酶應(yīng)用于肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)目有限,結(jié)論不一,但總體結(jié)果不佳。同時(shí)也缺乏對其作用機(jī)制的深入研究。本試驗(yàn)前二個(gè)部分結(jié)果顯示,PAI-1敲除的ALI小鼠較

16、野生型ALI小鼠凝血/纖溶功能改變不明顯,但病死率增加,TLR4信號途徑增強(qiáng),炎癥介質(zhì)釋放增加?？鼓幬锸欠裣驪AI-1一樣影響TLR4信號途徑,值得研究。
　　目的:
　　研究肝素及尿激酶對All小鼠TLR4信號途徑及凝血功能的影響;探討肝素及尿激酶的治療作用與PAI-1基因的關(guān)系;
　　方法:
　　將PAI-1基因敲除(KO)小鼠與野生型C56BL/6J小鼠(WT)均隨機(jī)分為對照組(WT對照組,KO對照組)、

17、肝素治療組(WT肝素治療組,KO肝素治療組)與尿激酶治療組(WT尿激酶治療組,KO尿激酶治療組)。對照組通過氣管內(nèi)滴注LPS5mg/kg:肝素治療組小鼠在LPS刺激同時(shí)尾靜脈注射肝素400IU/kg;尿激酶治療組小鼠在LPS刺激同時(shí)尾靜脈注射尿激酶5萬u/kg。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定各組小鼠血漿、肺組織炎癥介質(zhì)(IL-6、IL-10及IFN-γ)水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定肺組織IL-6、TLR4、SOCS1與IRAK-M的mRNA表達(dá)水

18、平,western-blot法測定IRAK-M、SOCS1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.WT對照組病死率為10％,生存時(shí)間22±1.3h;KO對照組病死率為40％,生存時(shí)間16.2±2.1h:WT肝素治療組病死率為15％與WT對照組相比、KO肝素治療組病死率為35％與KO對照組相比,P＞0.05;WT尿激酶治療組病死率為20％、KO尿激酶治療組病死率為45％,與WT對照組、KO對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2

19、.WT對照組ALI評分為8.5±0.5,肺微血管通透性81.02±11.35,W/D值5.48±0.51;KO對照組ALI評分為11.1±0.6,肺微血管通透性98.02±10.21,W/D值6.36±0.23;與WT對照組、KO對照組相比,WT肝素治療組及KO肝素治療組ALI評分減小(6.4±0.4,7.3±0.5,P＜0.05),肺微血管通透性下降(60.32±14.3,72.56±10.12,P＜0.05),W/D值降低(4.32

20、±0.60,5.0±0.50,P＜0.05);與WT對照組、KO對照組相比,尿激酶治療組的ALI評分,肺微血管通透性及W/D值也明顯減小,P＜0.05。
　　3.與WT對照組、KO對照組小鼠相比,肝素治療組、尿激酶治療組小鼠的凝血/纖溶異常改善。但肝素或尿激酶治療后的KO小鼠與WT小鼠之間,各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.ELISA結(jié)果顯示,與WT對照組、KO對照組小鼠相比,肝素治療組及尿激酶治療組小鼠血漿與肺組織IL-

21、6釋放減少,兩種基因型小鼠IL-6下降幅度基本一致;與WT對照組、KO對照組組小鼠相比,肝素治療組及尿激酶治療組小鼠血漿與肺IL-10、IFN-γ變化不明顯。
　　5.肝素治療組及尿激酶治療組小鼠肺組織IL-6mRNA水平較WT對照組、KO對照組小鼠明顯下降(P＜0.05),且兩種基因型小鼠下降幅度基本一致。
　　6.real-timePCR及western-blot結(jié)果均提示,與WT對照組、KO對照組相比,肝素治療組及尿激

22、酶治療組小鼠TLR4及TLR4負(fù)性調(diào)節(jié)因子IRAK-M、SOCS1變化不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.肝素、尿激酶治療改善了ALI小鼠的凝血/纖溶指標(biāo),但兩種基因型小鼠之間無明顯差異;肝素、尿激酶治療雖然減小了ALI評分、肺微血管通透性及W/D比值,但并不影響ALI的病死率。ALI的抗炎作用僅僅表現(xiàn)在降低了血漿及肺組織IL-6的釋放,但對ALI小鼠的TLR4及TLR4負(fù)性調(diào)節(jié)IRAK-M、SOCS1無影響。
　　2.肝素