中國(guó)南方β地貧41-42（-CTTT）移碼突變進(jìn)化歷程的基因轉(zhuǎn)換證據(jù).pdf

1、地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是一種由于α和β珠蛋白合成比例失衡所導(dǎo)致的嚴(yán)重的致死性遺傳病，是世界上最常見(jiàn)的人類常染色體單基因遺傳病之一。地貧在全球的熱帶和亞熱帶地區(qū)有著廣泛的分布和相當(dāng)高的攜帶率，最新的研究數(shù)據(jù)表明，該種疾病的基因攜帶者占全球人口總數(shù)的4.83％，而我國(guó)該病的高發(fā)區(qū)主要分布于長(zhǎng)江以南的地處熱帶和亞熱帶的各省區(qū)。地貧可以根據(jù)珠蛋白生成障礙的種類分為α地貧和β地貧兩大類，分別是由α珠蛋白和β珠蛋白合成障礙而引起。在我國(guó)β地貧攜帶者

2、當(dāng)中，β珠蛋白編碼區(qū)密碼子(Codon，CD)41/42位(CD41/42)的4堿基缺失(-CTTT)是最常見(jiàn)的致病突變，該突變?cè)谥袊?guó)南方人群中攜帶率約為1％左右，占所有中國(guó)南方β地貧致病突變的40％左右。 地貧之所以在熱帶和亞熱帶有如此高的攜帶率，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是與瘧疾的自然選擇相關(guān)，早在20世紀(jì)40年代，英國(guó)遺傳學(xué)家JBSHaldane就提出了地貧是因?yàn)榀懠驳倪x擇壓力導(dǎo)致其流行的假說(shuō)，類似的假說(shuō)和觀點(diǎn)的產(chǎn)生不僅是因?yàn)榈刎毟甙l(fā)

3、區(qū)域的地理分布與瘧疾流行區(qū)域的地理分布有著很大相似性，而且地貧的攜帶者在流行病學(xué)和分子病理學(xué)水平被證明可以抵抗瘧疾。進(jìn)入20世紀(jì)九十年代以來(lái)，隨著高通量DNA序列測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，以及測(cè)序成本的降低，針對(duì)人群的基因組水平足夠大范圍的測(cè)序已成為現(xiàn)實(shí)，在群體遺傳學(xué)水平上，科研人員對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥(G6PDDeficiency)、鐮刀型貧血癥(HbS)、血紅蛋白E(HbE)、血紅蛋白C(HbC)等血紅蛋白病與瘧疾的進(jìn)化關(guān)系都展開(kāi)了

4、初步的探索，并得到了一些關(guān)于瘧疾的自然選擇壓力在攜帶這些致病突變的染色體上所留下的基因組水平和群體遺傳學(xué)水平的證據(jù)，進(jìn)一步讓我們確信前人關(guān)于這些疾病受到瘧疾的自然選擇的假說(shuō)是正確的，但是在β地貧方面，還沒(méi)有群體遺傳學(xué)水平相關(guān)的研究報(bào)道。與此同時(shí)，亦沒(méi)有針對(duì)β地貧的分子進(jìn)化領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道。 本研究預(yù)計(jì)通過(guò)針對(duì)CD41/42β地貧相關(guān)樣本的群體遺傳學(xué)研究，分析得到瘧疾的自然選擇壓力作用于CD41/42β地貧，從而在基因組水平上留下痕

5、跡的證據(jù)，達(dá)到證明CD41/42β地貧和瘧疾的自然選擇關(guān)系的目的。同時(shí)根據(jù)研究過(guò)程中得到的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)CD41/42β地貧等位基因和單倍型在中國(guó)南方人群里的發(fā)生、發(fā)展和變化的進(jìn)化歷程做一些初步的探索，以填補(bǔ)該遺傳疾病在分子進(jìn)化領(lǐng)域的研究空白，并可以給今后對(duì)其他遺傳疾病的類似研究提供參考。 材料與方法： 我們選擇了以中國(guó)南方人群β地貧中攜帶率最高的一種突變--CD41/42作為研究靶點(diǎn)，以β珠蛋白基因簇作為基因組上的

6、研究區(qū)域，采集了24個(gè)正常人和中國(guó)南方九省的共16個(gè)CD41/42β地貧攜帶者作為研究樣本，抽提外周血基因組DNA，然后對(duì)該樣本每個(gè)個(gè)體β珠蛋白基因簇的ψβ-globin、δ-globin、RecombinationHotspot和β-globin區(qū)域分別進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增，并對(duì)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定。上述四個(gè)片段總長(zhǎng)共15.933kb，覆蓋20.693kb的基因組范圍。 測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStarLasergene

7、軟件比對(duì)得到49個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，對(duì)所有位點(diǎn)用HWsim軟件進(jìn)行了Harding-Weinberg平衡檢驗(yàn)之后使用Phase2.1.1軟件對(duì)這49個(gè)SNP位點(diǎn)以及CD41/42位點(diǎn)進(jìn)行單倍型推斷和重組熱點(diǎn)區(qū)的預(yù)測(cè)。在推斷得到的單倍型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了如下的群體遺傳學(xué)分析：首先運(yùn)用Arlequin3.01軟件對(duì)整個(gè)樣本進(jìn)行了Tajima’sD中性檢驗(yàn)，該結(jié)果是從群體遺傳

8、學(xué)的角度判斷研究區(qū)域是否受到自然選擇和受到何種自然選擇的依據(jù)：運(yùn)用DnaSP4.0軟件對(duì)樣本進(jìn)行四配子檢驗(yàn)，用以測(cè)定在研究區(qū)域是否有重組發(fā)生和重組在何處發(fā)生；運(yùn)用Network4.1.1.2軟件對(duì)樣本的單倍型進(jìn)行了中介網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，用以分析各種單倍型之間的親緣關(guān)系；同時(shí)用.Arlequin3.01軟件進(jìn)行連鎖不平衡(LinkagcDisequilibrium，LD)計(jì)算并繪制連鎖不平衡圖譜，可以用來(lái)給之前各種分析提供參考。 把上

9、述各種分析得出的結(jié)果進(jìn)行綜合總結(jié)和討論，可以對(duì)CD41/42β地貧等位基因的進(jìn)化歷程和各種單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系得出一個(gè)較為可信的推測(cè)。 因?yàn)槲覀兊臉颖静⒎前凑誄D41/42的自然攜帶率進(jìn)行采集，而是人工構(gòu)建的樣本(artificialsample)，所以我們?cè)谥行詸z驗(yàn)和LD計(jì)算的過(guò)程中都充分考慮了人工樣本給結(jié)果帶來(lái)的偏差，并在文中做出了討論。 結(jié)果與討論： 用DNAStar軟件對(duì)PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析，共

10、找到49個(gè)SNP位點(diǎn)，MonteCarloPermutationtest的結(jié)果顯示，除去一個(gè)位點(diǎn)之外，其余位點(diǎn)均符合Harding-Weinberg平衡。Phase軟件預(yù)測(cè)出研究區(qū)域含有一個(gè)重組熱點(diǎn)區(qū)，這與前人的研究結(jié)果和我們之后的LD分析結(jié)果是一致的，為了避免重組熱點(diǎn)區(qū)帶來(lái)的不確定因素的干擾，我們僅僅對(duì)重組熱點(diǎn)區(qū)下游的包含CD41/42位點(diǎn)的β-globin區(qū)域共16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了單倍型推斷，共得到20種單倍型，其中包括16種正常單

11、倍型和4種突變單倍型。 Tajima'sD中性檢驗(yàn)在所研究樣本的β-globin區(qū)域得到的是負(fù)值，且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這個(gè)結(jié)果表明，該區(qū)域受到平衡選擇(balancingselection)的作用，而已知的能對(duì)該區(qū)域帶來(lái)這種作用的候選對(duì)象只有瘧疾。ψβ-globin、δ-globin、RecombinationHotspot三個(gè)區(qū)域的中性檢驗(yàn)結(jié)果各不相同，且結(jié)果均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也說(shuō)明了重組熱點(diǎn)區(qū)確實(shí)會(huì)給我們的分析帶來(lái)不穩(wěn)

12、定的干擾。考慮到我們的樣本是人工構(gòu)建的非隨機(jī)樣本，我們還把樣本中的突變?nèi)旧w條數(shù)按不同組合刪減到符合實(shí)際攜帶率的水平，并對(duì)由此產(chǎn)生的多個(gè)樣本也進(jìn)行了Tajima'sD中性檢驗(yàn)，而得出的結(jié)果與原始樣本的結(jié)果是一致的，這也說(shuō)明我們的樣本在一定程度上是可以代表隨機(jī)樣本的。 四配子檢驗(yàn)和LD分析的結(jié)果提示在β-globin區(qū)域內(nèi)部也發(fā)生過(guò)一定程度的重組，那么這些重組事件會(huì)否對(duì)CD41/42等位基因和單倍型的播散帶來(lái)影響?根據(jù)單倍型構(gòu)建的

13、中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示中國(guó)南方人群在β-globin區(qū)域的單倍型分為三個(gè)大支，每個(gè)支都有其主要單倍型，而CD41/42β地貧單倍型(βCD41/42haplotype)只分布在其中兩個(gè)較為年輕的支上，在無(wú)限位點(diǎn)模型下，討論推斷CD41/42突變最早發(fā)生于兩支之一的主要單倍型上，然后通過(guò)與另一支的主要單倍型發(fā)生基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)從而把CD41/42等位基因傳播到另一支上，從而產(chǎn)生新的遺傳背景完全不同的βCD41/42hapl

14、otype，同時(shí)我們還可以觀測(cè)到在我們這20種單倍型中，有多種單倍型都很可能是由于另外兩種單倍型之間發(fā)生基因轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生的。這樣的研究結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)換對(duì)于中國(guó)南方人群β-globin區(qū)域單倍型的多樣性和致病突變單倍型--βCD41/42單倍型的播散起著主要作用。 本研究得到的上述成果在群體遺傳學(xué)水平上證明了瘧疾與β地貧的自然選擇關(guān)系，并且通過(guò)對(duì)所研究樣本β-globin區(qū)域單倍型的分析得知基因轉(zhuǎn)換在βCD41/42單倍型的發(fā)展和播