萬古霉素緩釋微球復合自體微小顆粒骨治療感染性骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　感染性骨缺損是創(chuàng)傷性慢性骨髓炎,是一種嚴重的骨組織感染性疾病,通?？蓪е鹿堑倪M行性、炎性破壞,無法控制的炎癥破壞是其主要特點,后期還存在對抗生素治療反應不明感、反復復發(fā)等特征。革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌是導致骨髓炎的最常見致病菌,占全部骨髓炎病例的80％左右,骨感染造成的死亡率達27-30%.萬古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)引起的嚴重感染疾病的重要藥物,是目前國內治療MRSA感

2、染的首選用藥。但是由于其全身用藥量較大,對耳腎均有毒性,局部用藥半衰期短,反復用藥又增加了感染率,無法達到有效的長期控制感染的效果,給臨床治療帶來了困難。早在1906年,Ehrlich就提出了靶向給藥的設想,隨著生物醫(yī)學的發(fā)展,這一設想逐漸成為現實。1980年Klemm首次局部應用慶大霉素/聚甲基丙烯酸酯防治骨及軟組織感染獲得成功引起了人們的重視。
　　本實驗旨在通過復乳-固化法制作萬古霉素緩釋微球,復合微小顆粒骨一期植骨治療感染

3、性骨缺損的效果,探討新的治療感染性骨缺損的方法,為其應用臨床提供實驗依據。
　　實驗方法:
　　1、載萬古霉素PLGA微球的制備
　　取2mgPLGA溶解于20mL二氯甲烷中,攪拌制備成初乳相;取2mL吐溫-80,加入40mL蒸餾水中,以700r·m-1轉速攪拌制得第二初乳相;取1mL濃度為200mg·mL-1的萬古霉素溶液,加入PLGA溶液中,4000r·m-1轉速下分散、攪拌,再將該混合液加入初乳相吐溫-80混合液

4、中,用高速分散器(XHF-D,寧波新芝生物科技股份有限公司)4000r·m-1轉速下分散,制成PLGA微球的初始液,室溫下持續(xù)攪拌4小時靜置待有白色沉淀附著燒杯底后,6000r·m-1(3-18K,SIGMA公司,德國)速度離心清洗3遍后,-20℃冷凍干燥(Scient2-10N,寧波新芝生物科技股份有限公司),制得載萬古霉素的PLGA微球。分別對其進行形態(tài)特征及粒徑分布測定,微球中萬古霉素的含量測定,含量測定中還包括:載藥率和包封率,

5、抗生素溶液穩(wěn)定性,體外釋放,微球中萬古霉素活性和MIC測定。
　　2、動物實驗
　　取48只家兔,按沈霖造模法造成雙側橈骨中上段慢性骨髓炎模型,將動物隨機分為3組,每組16只。1個月后按常規(guī)方法將骨髓炎局部作徹底清創(chuàng),并造成橈骨中上段1cm節(jié)段性骨缺損的條件下,A組一期行自體小顆粒骨植入;B組一期行自體微小顆粒骨和萬古霉素植入;C組一期行自體微小顆粒骨和萬古霉素緩釋微球混合植入。分別于術前、術后1天、3天、1周、2周、4周測

6、定各組動物血清C反應蛋白及血沉,并于術后2周、4周、8周、12周每組處死4只兔子行植骨區(qū)大體形態(tài),X線及組織學觀察并進行評分。
　　結果:
　　1、微球測定結果
　　微球表面光滑、無孔隙,載藥率達到(4.40±0.2635)%,包封率達到(48.51±14.827)%,HV-PLGAMSs溶解7天的累積釋放率達到43.36%,有相對比較長的釋放周期;在體外抑菌試驗中,HV-PLGAMSs釋放的萬古霉素作用效果明顯。

7、r>　　2、動物實驗結果
　?、俅篌w形態(tài)觀察:其中A組1只家兔術后2周植骨部位出現竇道,流出膿性分泌物;術后4周,A組局部可見植入之顆粒骨被纖維組織覆蓋,B、C組局部可見骨痂形成,針刺感較硬;術后8周,A組可見骨痂形成填滿骨缺損區(qū),B、C組骨痂形成致密,骨缺損區(qū)完全愈合,骨折端連接良好;術后12周,各組骨缺損區(qū)完全愈合,骨折端連接良好。
　　②血清C反應蛋白:在術后第1周時B組顯著低于A組水平(p<0.05),C組顯著低于B

8、組水平(p<0.05),第4周時A組仍維持在較高水平,B、C組接近正常水平。
　?、垩?在術后第2周時B組顯著低于A組水平(p<0.05),C組顯著低于B組水平(p<0.05),第4周時A組仍維持在較高水平,B、C組接近正常水平。
　　④植骨區(qū)X線觀察及評分:4周時A組可見有骨痂形成,仍可見植入之顆粒骨,骨折線清晰,B、C組可見有骨痂形成基本連接骨段端;8周時A組骨痂量增加,骨折線已基本消失,髓腔尚未通,B、C組新生皮質骨

9、結構出現,與宿主皮質骨連接,髓腔已基本再通;12周時三組均可見骨缺損區(qū)已達骨性愈合,髓腔再通。術后第2、4、8周B組X線和組織學評分均優(yōu)于A組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),B、C組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第12周A、B、C三組X線評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　?、葜补菂^(qū)組織學觀察及評分:2周時A組可見植入之大塊顆粒骨組織,有纖維組織填充,B、C組見有大量軟骨島形成,C組亦可見有部分微球未被吸收,附著于軟

10、骨島附近。4周時A組骨小梁稀疏,走行不規(guī)則,B、C組骨小梁較為致密,走行較為一致,C組新生骨組織周圍未發(fā)現有微球存在。8周時A組骨小梁走行一致,原始髓腔將要形成,B、C組骨小梁形成的編織骨已逐漸向板層骨過渡,骨板周圍見大量成骨細胞,髓腔基本貫通。12周:三組骨缺損區(qū)編織骨被板層骨替代,骨質較厚為片狀,骨陷窩大量分布其中,髓腔再通。術后2、4、8、12周組織學評分A、B組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),B、C組相比差異均無統(tǒng)計學意

11、義(P>0.05)。
　　結論:
　　1、利用W/O/W方法制作的萬古霉素緩釋微球,對萬古霉素藥物本身無影響。
　　2、萬古霉素PLGA緩釋微球在作用于金黃色葡萄球菌時,其抑菌效果與單純萬古霉素相同,且抑菌時間長。
　　3、手術徹底清創(chuàng)后,自體微小顆粒骨復合萬古霉素緩釋微球植入法,對于治療感染性骨缺損是可行的。
　　4、對于治療感染性骨缺損時,萬古霉素緩釋微球對成骨作用無影響。
　　5、對于感染性骨缺