新型肝癌標(biāo)志物Glypican-3 ELISA檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:制備抗GPC3單克隆抗體和多克隆抗體,并建立GPC3 ELISA檢測(cè)方法,探討其在原發(fā)性肝癌血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 方法:分別構(gòu)建Glypican-3基因1333-1548 bp片段及73-1074bp片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b-GPC3(1333-1548bp)和pProEX Hta-GPC3(73-1074bp)，異丙基硫代-β-d-半乳糖苷( IPTG) 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并用Ni-NTA 樹(shù)脂親和層析柱純化蛋白

2、。利用純化的GPC3蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)HAT、HT選擇培養(yǎng)及有限稀釋法進(jìn)行克隆化，制備抗GPC3的單克隆抗體，用ELISA、Western blot進(jìn)行特性鑒定?；瘜W(xué)合成多肽GPC3-Ag1（73－86aa）CCSRKMEEKYQLTh和多肽GPC3-Ag3（382－396aa）ETLSSRRRELIQKLK，并分別與KLH偶聯(lián)。利用偶聯(lián)好的多肽GPC3-Ag1、GPC3

3、-Ag3及純化的GPC3蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗GPC3的多克隆抗體。從上述多克隆抗體和單克隆抗體中通過(guò)不同的抗體組合檢測(cè)陽(yáng)性血清和陰性血清篩選最佳配伍抗體；通過(guò)棋盤(pán)滴定法確定包被抗體的最佳包被濃度和檢測(cè)抗體的最佳稀釋度，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)條件建立雙抗體夾心ELISA方法。利用上述建立的ELISA方法，檢測(cè)HCC、肝炎、肝硬化、其他惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移患者及正常人血清，通過(guò)ROC曲線選擇最佳診斷界值，探討血清GPC3在HCC診斷

4、中的應(yīng)用價(jià)值。最后我們檢測(cè)了151例HCC患者血清AFP和GPC3水平，探討聯(lián)合檢測(cè)GPC3+AFP在HCC診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 結(jié)果:獲得11株抗GPC3（25－358aa）單克隆抗體，其中7株為IgG1亞型、4株為IgG2a亞型，輕鏈均為κ鏈。7株抗GPC3（444－516aa）單克隆抗體，均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。獲得抗GPC3-Ag1，GPC3-Ag3，GPC3（444aa-516aa）三種多克隆抗體。經(jīng)Weste

5、rn Blot證實(shí)獲得單克隆抗體和多克隆抗體均可以特異識(shí)別GPC3抗原。成功地建立了雙抗體夾心ELISA定量方法，最低檢測(cè)量為1.6ng/ml，并將其應(yīng)用于肝癌病人血清GPC3抗原的檢測(cè)。根據(jù)ROC曲線結(jié)果，以30ng/ml為診斷界值，364例HCC患者中143例血清GPC3陽(yáng)性，陽(yáng)性率為39％；96例肝炎/肝硬化患者中6例血清GPC3陽(yáng)性，陽(yáng)性率為6.3％；106例正常人中3例血清GPC3陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2.8％, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明HCC

6、患者血清和后兩組血清GPC3含量有顯著差異（P＝0.000）。我們同時(shí)檢測(cè)了151例HCC血清的AFP和GPC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)以AFP為診斷指標(biāo)時(shí)，HCC檢出率為49％，單獨(dú)以GPC3為診斷指標(biāo)時(shí)，HCC檢出率為40％，而AFP＋GPC3聯(lián)合診斷時(shí)，HCC的檢出率提高到72％。 結(jié)論:通過(guò)自行制備的抗GPC3單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，該方法可以應(yīng)用于肝癌病人血清GPC3抗原的檢測(cè)。GPC3作為一種新