中國南方人群β-地中海貧血CD41-42（-CTTT）突變的起源與擴散的群體遺傳學(xué)研究.pdf

1、背景與目的： β-地中海貧血(β-thalassemia，簡稱β-地海)是全球最常見、對人類健康危害最大的單基因遺傳病之一，其分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由于β-珠蛋白基因缺陷，導(dǎo)致血紅蛋白分子中β-珠蛋白肽鏈的合成減少或缺如，從而引起血紅蛋白的α/β珠蛋白肽鏈比例失衡，進而導(dǎo)致血紅蛋白不穩(wěn)定、紅細胞破壞而產(chǎn)生以溶血性貧血為主的癥狀群，在臨床上表現(xiàn)為輕重不等的慢性進行性溶血性貧血。β-地貧是我國長江以南各省區(qū)人群中發(fā)生率最高、危害最為嚴重的

2、遺傳病之一，其中尤以廣西、廣東、海南等地發(fā)生率為甚，廣西和廣東人群攜帶率分別為4.8％~6.78％和2.54％~3.36％，海南人群的攜帶率估計約為2.7％，而海南黎族人群高達8‰~11.6％。 流行病學(xué)、遺傳學(xué)和體外實驗研究結(jié)果表明，人類β珠蛋白基因是受瘧疾選擇作用最明顯的基因之一。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，β珠蛋白基因常見的變異HbS(β6Glu→Val)、HbC(βGlu→Lys)和HbE(β26Glu→Lys)以及β-地貧主

3、要分布在非洲、地中海地區(qū)、中東、東南亞和中國南方等熱帶、亞熱帶地區(qū)，與瘧疾的流行區(qū)域基本一致。細胞學(xué)和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白病HbS、HbC、HbE以及β-地貧的個體和紅細胞均具有抵抗瘧原蟲感染和降低惡性瘧嚴重程度的作用。最近對β-珠蛋白基因簇單核苷酸多態(tài)性的連鎖不平衡及單體型的分析發(fā)現(xiàn)，HbS、HbC和HbE的發(fā)生可能是人類進化史上近5000年內(nèi)獨立發(fā)生的事件，提示人類β珠蛋白基因變異與瘧疾選擇作用密切相關(guān)。由于瘧疾流行區(qū)人群中雜

4、合子優(yōu)勢具有保護人類免患瘧疾或減緩惡性瘧嚴重程度的作用。因此，這些具有選擇優(yōu)勢的基因在瘧疾發(fā)生地人群中的高頻率有利于人類抵抗瘧疾感染而得以生存和繁衍。 β-地貧的基因突變具有高度的異質(zhì)性，不同種族人群擁有自己一組獨特的β-地貧基因突變譜，表現(xiàn)為明顯的地域性或群體特異性。到目前為止，在我國南方人群中至少已發(fā)現(xiàn)36種β地貧突變類型。其中，常見的突變基因主要有8種，包括CD41-42(-CTTT)、IVS-2-654C→T、CD71-

5、72(+A)、CD17A→T、-28A→G。CD26G→A(HbE)、-29A→G和CD43G→T突變，分布在我國東南和西南等南方地區(qū)的人群中。值得注意的是，我國人群的β-地貧基因突變類型中，C041-42(-CTTT)缺失是一種最常見和分布最廣泛的突變，在我國南方各省人群中，該突變約占地貧突變的40％，而黎族人中β地貧基因突變幾乎全為C041-42(-CTTT)突變。我們最近的研究說明基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)可能是人群

6、中CD41-42(-CTTT)突變擴散的主要分子機制。對于特定人群來說，常見和廣泛分布的突變往往與其歷史和種群變遷相關(guān)，因此，可以通過遺傳病突變來追朔其建立者或祖先，進而闡述人群起源和進化史，這也是目前國際上分子進化研究的前沿課題。 壯族是我國人口最多的少數(shù)民族，主要聚居在廣西壯族自治區(qū)的南部和中西部地區(qū)，源于古代百越的一支-璐越和甌越，是我國歷史上民族的主體很少遷徙的民族之一。黎族被認為是海南的土著民族，其先民也源于駱越，在海

7、南島至少有3000年以上的歷史，與我國南方屬漢藏語系的操壯侗語族諸語言的壯族、侗族、水族、傣族、布依族等民族有密切的淵源關(guān)系。盡管β珠蛋白基因CD41-42(-CTTT)突變是包括壯族和黎族人群在內(nèi)的我國南方地區(qū)人群中最常見的β-地貧突變，但是，該突變何時出現(xiàn)?在黎族人群遷徙至海南前出現(xiàn)還是遷徙至海南后出現(xiàn)?在起源上，黎族、壯族和漢族人群的CD41-42(-CTTT)之間有何關(guān)系?是否與瘧疾選擇作用存在相關(guān)性?黎族人群為什么有如此高的攜

8、帶率?到目前為止尚未有確切的分子遺傳學(xué)依據(jù)。本研究根據(jù)壯族和黎族密切的歷史淵源關(guān)系以及黎族在海南有史可證的時代背景，選擇在廣西和海南當?shù)厝巳褐蠧D41-42(-CTTT)這一最常見的β-地貧突變?yōu)閷ο?，通過群體遺傳學(xué)分析來闡述中國南方人群中這一具有選擇優(yōu)勢的致病突變的起源與擴散，并企圖解釋人群自然選擇的分子進化機制。 材料與方法： 1.實驗設(shè)計和樣品：在海南島采集2291例黎族人隨機樣品，在廣西地區(qū)采集1627例壯族人隨

9、機樣品，用于當?shù)厝巳旱摩?地貧基因頻率調(diào)查。以隨機數(shù)方式分別從上述海南2291例黎族人和廣西1627例壯族人中選出201例黎族人和354例壯族人樣品，并分別采集海南島黎族人居住地的200例漢族人隨機樣品和廣西地區(qū)壯族人居住地的262例漢族人樣品，用于中國南方人群β-地貧CD41-42(-CTTT)突變的分子進化研究。血液學(xué)參數(shù)和血紅蛋白A2定量用于篩查樣品中的β-地貧攜帶者，DNA診斷技術(shù)用于進行β-地貧攜帶者突變的分子診斷。經(jīng)突變分析

10、確診，并在上述二地的四組樣品中排除了其他類型的β-地貧突變樣品后，核準用于群體遺傳學(xué)分析的樣品合計907例，分別為：海南黎族人201例，海南漢族人200例，廣西壯族人280例和廣西漢族人226例。此外，我們還采集了8例β-地貧CD41-42(CTTT)純合子患者樣品用于本研究，分別為海南黎族人1例，海南漢族人3例、廣西漢族人2例和廣東漢族人2例。 2.方法：用鹽析法或磁珠法提取外周血白細胞DNA。用全血細胞計數(shù)(FBC)和HbA

11、2含量測定篩查β-地貧攜帶者；用等位基因特異PCR和反向點雜交診斷41-42(-CTTT)突變。用PCR擴增β-珠蛋白全長基因及其周圍序列(3.5kb片段)，用雙向核苷酸序列測定分析β-珠蛋白基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。用基因記數(shù)方法計算出各個位點的基因型頻率和等位基因頻率，用x2檢驗進行基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度和各人群的SNP等位基因頻率比較，用Fisher's確切概率法檢測各個人群之間的各種CD41-42(

12、-CTTT)單倍型的頻率有無統(tǒng)計學(xué)差異。計算各個人群的單核苷酸多態(tài)性雜合度，用方差分析比較各個人群單核苷酸多態(tài)性雜合度的差異，并計算人群的分化指數(shù)，分析各個人群之間β-珠蛋白基因遺傳結(jié)構(gòu)的分化情況。用Phase2.1.1軟件進行單倍型分析，用x2檢驗進行各個人群單倍型頻率的比較。用DnaSP4.10進行FourGamete分析，進行β-珠蛋白基因中重組事件以及發(fā)生位置的評估。用Alequin3.01軟件計算各個位點之間的兩兩相對連鎖不平

13、衡系數(shù)D’值、兩兩相對連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)r2值、各個人群β-珠蛋白基因的核苷酸分離位點數(shù)θ值和任意兩序列之間核苷酸差異的平均數(shù)π值，并計算Tajima’sD值進行分析對象的中性檢驗，評估SNP之間的兩兩不平衡關(guān)系及與選擇作用的關(guān)系。用Net-Work4.1.1.2軟件構(gòu)建樣品的單倍型系統(tǒng)樹，觀察各種單倍型之間的演變關(guān)系。參考相關(guān)史料來解釋和討論基因突變及其人群起源和進化歷史。 結(jié)果與討論： 在海南島黎族人群隨機大樣品調(diào)查

14、得出的θ地貧CD41-42(-CTTT)突變攜帶率為8.16％，未發(fā)現(xiàn)其它突變，隨機抽取的201例黎族人CD41-42(-CTTT)突變的攜帶率為10.45％，抽樣樣本和人群的CD41-42(-CTTT)突變攜帶率結(jié)果之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。根據(jù)血液學(xué)參數(shù)和HbA2含量，在1624份廣西壯族隨機大樣品中調(diào)查得出θ地貧突變攜帶率為6.64％。在隨機抽取的354份壯族樣品和262例漢族樣品中，CD41-42(-CTTT)突變攜帶

15、率的結(jié)果分別為3.39％和3.05％，在剔除其它β-地貧突變后，最終入選的280例壯族樣品和226例漢族樣品中CD41-42(-CTTT)突變攜帶率的結(jié)果分別為3.92％和3.54％，兩組壯族樣本或兩組漢族樣本之間CD41-42(-CTTT)突變攜帶率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.根據(jù)人群單倍型的特點、LD類型、FourGamete結(jié)果以及重組和突變或缺失發(fā)生的機率，結(jié)合黎族人群與壯族人群的起源和分化的時

16、間以及黎族遷徙史，我們推測中國人群的CD41-42(-CTTT)突變可能是單一起源，發(fā)生在黎族和壯族人群分化之前，至少已有3000的歷史，CD41-42(-CTTT)缺失突變單倍型HP20可能是最早出現(xiàn)的單倍型，然后在人群傳播過程中，通過基因轉(zhuǎn)換的方式產(chǎn)生HP47。 2.連鎖不平衡和遺傳多樣性分析結(jié)果表明海南漢族、海南黎族、廣西漢族和廣西壯族人群的β-珠蛋白基因在進化過程中受到平衡選擇的作用，可能與瘧疾選擇作用相關(guān)。瘧疾選擇作用

17、可能是造成我國南方地區(qū)人群β-地貧攜帶率高于北方人群的重要原因之一。 3.建立者效應(yīng)可能是黎族人群CD41-42(-CTTT)突變攜帶率增高的重要原因。遺傳漂變可能是導(dǎo)致海南漢族、廣西漢族和廣西壯族人群CD41-42(-CTTT)突變攜帶率低于黎族人群的原因之一。 4.人群遷徙也是影響海南漢族、廣西漢族和廣西壯族人群CD41-42(-CTTT)突變分布的因素之一。廣西漢族人群和廣西壯族人群之間的CD41-42(-CTTT