維甲酸受體α(RARα)泛素化降解的調(diào)控機制研究.pdf

1、背景:
　　誘導分化是指惡性腫瘤細胞在分化誘導劑的作用下，向正?；蚪咏５募毎较蚍只孓D的現(xiàn)象，它強調(diào)逆轉腫瘤細胞惡性表型，使其趨于成熟分化，一般不引起腫瘤細胞的殺傷，從而克服了傳統(tǒng)化療在殺傷腫瘤細胞的同時對正常組織細胞的損傷所帶來的毒副作用。腫瘤的分化療法作為一種區(qū)別于傳統(tǒng)腫瘤治療理念的治療手段已越來越多地得到了人們的關注。目前，常用的分化誘導劑包括維甲酸（retinoic acid，RA）類化合物、極性化合物、細胞因子、維

2、生素D3及其類似物、某些抗腫瘤藥物及中草藥等，其中RA類化合物是分化誘導劑中最為重要、療效最為確切并應用于臨床的一類藥物。隨著全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）分化治療急性早幼粒細胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia, APL）的成功，RA類藥物也被越來越多地用于預防及治療包括乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的惡性腫瘤，而RA類藥物的廣泛應用也促使研究人員

3、對其分化誘導機制進行了深入研究，以期尋找與細胞分化有關的潛在藥物作用靶點，并基于開發(fā)全新的高效分化誘導劑及發(fā)現(xiàn)有效的藥物聯(lián)用方案而指導分化療法在臨床的合理應用。
　　已有研究表明，RA通過與維甲酸受體結合而發(fā)揮誘導細胞分化的作用，維甲酸受體包括RARs（retinoic acid receptors）和RXRs（retinoid X receptors）二類，分別有α，β，γ三種亞型。維甲酸受體作為配體誘導的轉錄因子形成RAR/R

4、XR異二聚體，與維甲酸反應元件（RA response elements，RAREs）結合而啟動下游分化相關基因的轉錄。然而隨著研究的深入，有研究人員發(fā)現(xiàn)RA在誘導細胞分化的過程中能夠促使維甲酸受體α（RARα）發(fā)生泛素蛋白酶體依賴的降解，本實驗室的前期研究也已表明，RARα的這種泛素化降解并不利于ATRA分化誘導作用的充分發(fā)揮，而采用蛋白酶體抑制劑如MG132及PS341等能有效逆轉ATRA引起的RARα下調(diào)，并協(xié)同ATRA促進細胞分

5、化。因此探討RARα泛素化降解的調(diào)控機制有望為尋找基于RA的分化療法療效的增強提供全新的突破方向。
　　本研究將以ATRA誘導細胞分化過程中的相關分子現(xiàn)象為出發(fā)點，圍繞蛋白質的翻譯后修飾及蛋白-蛋白相互作用等兩個層面，從三個方向尋找及探討RARα泛素化降解過程的調(diào)控因子:
　　一、RARα的sumo-1修飾對其泛素化降解的影響。已有文獻表明，RARα可以被sumo-1修飾，而sumo-1已被證實能夠通過多種分子機制以不同方式

6、調(diào)控蛋白質的泛素化降解過程，因此sumo-1是否及如何參與調(diào)節(jié)RARα的泛素化降解是本課題所要深入研究的內(nèi)容之一;
　　二、E2F1調(diào)控RARα泛素化降解的作用研究。細胞內(nèi)重要的轉錄因子E2F1通過其轉錄活性調(diào)控下游蛋白的表達，參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)諸多分子事件。而我們的初步研究表明，E2F1能夠調(diào)控RARα的蛋白水平，卻并不影響其mRNA水平，因此在這一部分中我們將深入研究E2F1是否具有調(diào)控RARαt泛素化降解過程的作用;
　　

7、三、MDM2介導RARα泛素化降解的機制研究。蛋白的泛素化降解過程是一個由多種酶參與調(diào)控的有序過程，而泛素E3連接酶是整個過程中至關重要的因子，其直接決定了降解過程的靶向性及準確性，在蛋白質的泛素化降解過程中處于中心環(huán)節(jié)。我們的初步研究表明，具有泛素E3連接酶活性的蛋白MDM2可能具有促進RARα泛素化降解的功能，因此本部分的研究我們將基于前期的初步研究結果，探討MDM2是否可能為RARα的泛素E3連接酶。
　　第一部分RARα的

8、sumo-1修飾對其泛素化降解的影響
　　目的:RARα在其配體RA作用下通過與其他信號分子的相互作用調(diào)控與細胞生長、分化、存活及死亡等相關的諸多分子事件，被認為是最重要的維甲酸受體之一。已有研究表明，RARα在RA作用過程中發(fā)生泛素化降解，然而對于RA通過何種分子機制促進RARα的泛素化降解卻鮮有報道。小泛素樣蛋白sumo-1于近年來被證實能夠共價修飾在細胞生命活動中起重要作用的多種蛋白質，并在調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要而復雜

9、的作用。本文將以ATRA作為工具藥，系統(tǒng)研究RARα的sumo-1修飾在其泛素化降解及細胞分化過程中的作用。
　　方法與結果:在已有文獻報道RARα能夠被sumo-1修飾的基礎上，我們通過對RARα蛋白編碼區(qū)氨基酸序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，第399位賴氨酸完全符合已被證實能夠與sumo蛋白結合的賴氨酸的特點，因此第399位賴氨酸可能為RARα上sumo-1的結合位點?；诖耍覀兺ㄟ^點突變技術將編碼第399位賴氨酸的密碼子進行了突變，使

10、其轉而編碼精氨酸，得到RARα-K399R的突變質粒，并進一步采用免疫沉淀及Western blotting的方法在COS7細胞中證實第399位賴氨酸的突變顯著減弱了RARα的sumo-1修飾水平，因此我們認為，第399位賴氨酸確實為RARα的sumo-1修飾位點。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)ATRA在促進RARα泛素化降解的過程中伴隨著sumo-1蛋白及與sumo-1結合的RARα蛋白的下調(diào)，提示sumo-1可能參與RARα泛素化降解過程的調(diào)控

11、。進而我們對比了野生型RARα(RARα-WT)及第399位賴氨酸突變的RARα（RARα-K399R）在蛋白穩(wěn)定性及泛素化降解過程中的差異。Western blotting結果顯示，采用CHX抑制蛋白的合成后，RARα-K399R的降解速度顯著高于RARα-WT，而第399位賴氨酸突變后，ATRA也同樣能增強RARα的泛素化水平并加速其降解。熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)及Real Time RT-PCR實驗則進一步證實在ATRA作用下R

12、ARα-K399R的轉錄活性顯著低于RARα-WT。同時，我們采用siRNA干擾技術對細胞內(nèi)的sumo-1進行了敲除，結果表明，sumo-1的低表達顯著降低了RARα的穩(wěn)定性及ATRA誘導的RARα轉錄激活水平。在此基礎上，我們采用流式細胞術對已轉染RARα-WT或RARα-K399R的HL60R細胞經(jīng)ATRA誘導后細胞表面抗原CD11b的表達進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，不同于RARα-WT，RARα-K399R并不能促使HL60R細胞發(fā)生分

13、化。而Western b1otting結果也證實，敲除U2OS細胞中的sumo-1后，ATRA誘導的U2OS細胞分化被顯著抑制。
　　結論:RARα的sumo-1修飾拮抗其泛素化降解，并促進了RARα的轉錄激活及ATRA誘導的細胞分化，對于ARα泛素化降解調(diào)控機制的研究是一個有益的補充。
　　第二部分E2F1調(diào)控RAR泛素化降解的作用研究
　　目的:E2F1是細胞內(nèi)重要的轉錄因子，通過其轉錄活性轉錄激活下游一系列與細胞

14、生長、凋亡及分化相關的蛋白的表達，在細胞生命活動中起著中心調(diào)節(jié)作用。隨著研究的深入，其不依賴于下游蛋白的轉錄激活而對靶蛋白的調(diào)控作用也越來越得到研究者的關注。我們的初步研究證實，E2F1可能參與調(diào)控RARα的泛素化降解過程。在本部分研究中，我們將在前期研究的基礎上在骨肉瘤U2OS細胞中深入探討E2F1調(diào)控RARα泛素化降解的作用，以期發(fā)現(xiàn)RARα泛素化降解過程的全新調(diào)控因子及不依賴于E2F1轉錄激活而受其調(diào)控的靶蛋白。
　　方法與

15、結果:首先，我們采用免疫組化技術對多例骨肉瘤臨床樣本中的RARα及E2F1蛋白表達情況進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn)RARα在約71.4％的骨肉瘤中呈陰性表達，而E2F1在約86.5％的骨肉瘤中呈陽性表達，且兩者表達水平呈一定的負相關，SPSS軟件計算其相關系數(shù)為-0.402。這一結果提示，E2F1與RARα間可能存在一定的調(diào)控作用。為深入研究這一作用，我們在U2OS細胞中分別采用脂質體轉染或siRNA干擾技術增加或減少了細胞內(nèi)E2F1的表達。W

16、estern blotting及RealTime RT-PCR結果顯示，E2F1高表達促進RARα的下調(diào)，而E2F1低表達則上調(diào)RARα，且這一作用并不依賴于RARα mRNA水平的改變。進一步地，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉E2F1高表達引起的RARα下調(diào)，而高表達E2F1則明顯降低RARα蛋白的穩(wěn)定性，縮短其半衰期。同時我們采用免疫沉淀技術證實下調(diào)細胞內(nèi)E2F1蛋白表達抑制了ATRA引起的RARα蛋白的多聚泛素化。以上結

17、果均表明，E2F1能夠通過影響RARα的泛素化降解過程調(diào)控細胞內(nèi)RARα蛋白水平。而熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)及Real Time RT-PCR實驗則證實E2F1在調(diào)控RARα穩(wěn)定性的基礎上負性調(diào)控了ATRA誘導的RARα轉錄激活。另一方面，通過免疫熒光技術我們發(fā)現(xiàn)U2OS細胞中內(nèi)源性的E2F1與RARα存在一定的共定位，而免疫沉淀及GST-pull down技術則進一步證實E2F1與RARα在體內(nèi)外均能發(fā)生相互結合。在此基礎上，我們構

18、建了多個不同功能區(qū)域缺失的E2F1質粒突變體，并將其分別與RARα共轉染至COS7細胞中，免疫沉淀結果顯示E2F1蛋白上的第191-379位氨基酸所在結構域可能為RARα在其上的結合區(qū)域。Westernblotting結果則表明當缺失191-379位氨基酸后，E2F1促進RARα下調(diào)的作用消失，即E2F1促進RARα降解依賴于兩者的直接結合?；贓2F1對RARα泛素化降解過程的調(diào)節(jié)作用，我們對E2F1在ATRA誘導的U2OS細胞分化過

19、程中的作用進行了研究。結果表明，E2F1依賴于與RARα蛋白的結合負調(diào)控ATRA誘導的U2OS細胞分化。而進一步地，我們發(fā)現(xiàn)E2F1在原代骨肉瘤細胞中的表達水平也在一定程度上決定了原代骨肉瘤細胞對ATRA的敏感性。
　　結論:E2F1通過與RARα蛋白的結合調(diào)節(jié)RARα的泛素化降解過程，并進一步負調(diào)控其轉錄活性及ATRA誘導的骨肉瘤細胞分化。
　　第三部分MDM2介導RARα泛素化降解的機制研究
　　目的:在前兩部分的

20、研究中，我們發(fā)現(xiàn)了兩個RARα泛素化降解過程的可能調(diào)控因子，而蛋白質依賴于泛素蛋白酶體通路的降解是一個由多種酶介導的復雜而有序的分子過程。其中泛素E3連接酶在整個過程中起著中心調(diào)節(jié)作用，其通過特異性地識別靶蛋白決定著整個過程的精確性。因此尋找RARα泛素化過程的泛素E3連接酶對于更好地理解RARα泛素化降解過程的調(diào)控具有積極的推動作用。在前期能與RARα結合的蛋白的篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)了MDM2這一細胞內(nèi)重要的泛素E3連接酶，因此本部分

21、的研究我們將在確定MDM2能夠促進RARα泛素化降解的基礎上致力于探討MDM2是否可能為RARα的泛素E3連接酶。
　　方法與結果:我們在U2OS細胞中采用ATRA作用后，細胞內(nèi)RARα蛋白發(fā)生時間依賴性下調(diào)。同時我們發(fā)現(xiàn)出核抑制劑LMB能夠顯著逆轉ATRA引起的RARα蛋白下調(diào)，即ATRA誘導的RARα泛素化降解發(fā)生于細胞質中。Westernblotting及免疫熒光實驗則證實，ATRA短時間處理U2OS細胞后，細胞內(nèi)MDM2蛋

22、白發(fā)生上調(diào)，并在細胞質中累積，這一結果提示MDM2可能與ATRA觸發(fā)的RARα泛素化降解有關。為了深入研究這一作用，我們在U2OS細胞中過表達了MDM2蛋白，Western blotting結果顯示，MDM2依賴于其泛素連接酶活性促進RARα蛋白下調(diào)，而這一作用在ATRA處理后更甚。同時我們構建了MDM2穩(wěn)定低表達的U2OS細胞株，并對其中RARα蛋白水平進行了檢測。結果表明，MDM2低表達上調(diào)了RARα蛋白水平，并增強了其蛋白穩(wěn)定性。

23、進一步研究顯示，MDM2高表達促進了ATRA引起的RARα多聚泛素化水平，而低表達則反之。同時體外泛素化實驗證實，MDM2的泛素連接酶活性在RARα的多聚泛素化過程中是不可或缺的。另一方面，我們采用免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)內(nèi)、外源性的MDM2及RARα均存在一定的共定位，免疫沉淀結果則進一步證實MDM2能與RARα發(fā)生相互結合，并且ATRA能夠促進兩者的結合。在此基礎上，采用免疫沉淀技術我們發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白上第1-109位氨基酸所在的結構域為R

24、ARα蛋白的結合位點，而同樣能夠結合于MDM2蛋白該結構域的小分子化合物Nutlin-3則能顯著干擾MDM2-RARα的結合。同時，Western blotting結果證實，缺失RARα結合結構域的MDM2蛋白不能促進RARα的下調(diào)，而Nutlin-3則能夠顯著逆轉ATRA引起的RARα蛋白下調(diào)，提示MDM2促進RARα泛素化降解的作用依賴于與RARα蛋白的相互結合。基于MDM2對RARα蛋白的負性調(diào)控，我們對MDM2在ATRA誘導的U

25、2OS細胞分化過程中的作用進行了研究。結果表明，高表達MDM2抑制了ATRA引起的U2OS細胞生長抑制、OPN、RUNX2、ALP等分化標記蛋白的上調(diào)及細胞內(nèi)ALP活性的增加，即過表達MDM2抑制ATRA誘導的U2OS細胞分化，而低表達MDM2則相反。同時，MDM2泛素連接酶活性抑制劑HLI373被發(fā)現(xiàn)能夠顯著上調(diào)RARα蛋白，降低其由ATRA引起的多聚泛素化水平，并協(xié)同ATRA增強U2OS及原代骨肉瘤細胞的分化水平。
　　結論: