不同發(fā)育時(shí)期小鼠睪丸引帶ERα、ERβ、GPER表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　睪丸引帶是影響睪丸下降的重要因素。在不同發(fā)育時(shí)期,睪丸引帶變化不同,包括生長、增大、退化、收縮等,這些變化與胚胎期睪丸的發(fā)育和下降密切相關(guān)。睪丸的發(fā)育和下降不全影響睪丸的功能,并進(jìn)而直接影響雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育。近年來研究表明,外源性雌激素可引起雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常增加。在有關(guān)的機(jī)理方面,已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的雌激素受體(ERα和ERβ)可以不同程度地表達(dá)于睪丸引帶組織,此外,也發(fā)現(xiàn)新型雌激素受體--G蛋白偶聯(lián)的雌激素膜受體

2、(GPER/GPR30)也表達(dá)于睪丸、膀胱、輸精管等男性泌尿生殖器官。提示雌激素有可能通過多種受體途徑影響男性泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育。雌激素(包括外源性雌激素)與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常的相關(guān)關(guān)系及機(jī)理目前備受關(guān)注,其中,外源性雌激素對睪丸引帶的影響還很少研究。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué),免疫電鏡,western blot等多種方法對不同發(fā)育時(shí)期小鼠睪丸引帶中的上述三種雌激素受體進(jìn)行了定性、定位和定量的研究。以期了解三種雌激素受體在睪丸引帶中的表達(dá)

3、,為后續(xù)研究雌激素通過睪丸引帶途徑影響小鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法:
　　昆明小鼠90只,按雌雄比例2:1合籠交配,以出現(xiàn)陰道栓作為受孕標(biāo)志,發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為妊娠0天,記為GD0(gestation day,GD),胎鼠組分別于GD17、GD19時(shí)取材。孕雌鼠待其自然分娩,以幼鼠出生當(dāng)天記為生后0天,計(jì)為PD0(postnatal day,PD)。分別于PD0、PD3、PD7、PD14、PD21時(shí)取材。<

4、br>　　分析不同發(fā)育時(shí)期(胎齡17天、19天,生后0天、3天、7天、14天、21天)小鼠睪丸引帶中雌激素受體(ERα、ERβ、GPER)的表達(dá)情況:
　　1.取上述不同發(fā)育時(shí)期的小鼠睪丸引帶,利用免疫組織化學(xué)檢測睪丸引帶上三種雌激素受體的表達(dá)情況。
　　2.取3天小鼠睪丸引帶,利用免疫電鏡技術(shù)對三種雌激素受體進(jìn)行定位,了解其表達(dá)情況。
　　3.取上述不同發(fā)育時(shí)期的小鼠睪丸引帶,利用蛋白質(zhì)印跡方法了解三種雌激素受體的表

5、達(dá)情況(定量)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織化學(xué)觀察:各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠睪丸引帶上ERα、ERβ及GPER陽性細(xì)胞均呈棕黃色或棕褐色,主要表達(dá)在睪丸引帶內(nèi)層疏松的間葉組織區(qū)內(nèi),外周較致密的細(xì)胞區(qū)內(nèi)弱表達(dá)或不表達(dá)。
　　2.免疫組織化學(xué)染色:隨著小鼠天齡的增加,可見各組ERα及GPER的陽性染色細(xì)胞均為生后3天小鼠睪丸引帶最高,但GPER的陽性染色細(xì)胞較ERα明顯弱且少;ERβ陽性染色細(xì)胞為生后0天最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果:

6、①ERα表達(dá)分析:生后0天、3天兩兩相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),余各發(fā)育階段組兩兩相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②ERβ表達(dá)分析:孕17天與孕19天兩兩相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),及生后0天與各組兩兩相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),余各發(fā)育階段之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③GPER表達(dá)分析:孕17天、孕19天、生后7天、生后14天、生后21天與各組之間相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);生后0天、3天兩兩相比無統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.免疫電鏡觀察:①ERα:細(xì)胞核可見散在的膠體金顆粒標(biāo)記。②ERβ:細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)可見少量膠體金顆粒標(biāo)記。③GPER:細(xì)胞質(zhì)內(nèi)偶見個(gè)別膠體金顆粒標(biāo)記。
　　4.Western blot檢測:隨著小鼠天齡的增加,均檢測到ERα、ERβ及GPER的表達(dá),各組目的蛋白表達(dá)均不一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:①ERα的表達(dá)量:胎齡時(shí)期(孕17天、孕19天)兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);生后0天、生后

8、3天兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);其余各組之間相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。②ERβ的表達(dá)量:孕19天、生后0天、生后3天兩兩比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。③GPER的表達(dá)量:孕17天、孕19天與生后各組之間比較均有差異(p<0.05);生后3天與各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);生后7天、14天、21天與生后各組(生后3天、7天、14天、21天

9、)比較差異均有統(tǒng)計(jì)意義(p<0.05),其余各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.正常小鼠睪丸引帶組織中,各個(gè)發(fā)育階段均有ERα、ERβ及GPER表達(dá),但表達(dá)的位置及含量均不一致。
　　2.正常小鼠睪丸引帶組織中,ERα、ERβ及GPER主要存在于睪丸引帶內(nèi)層疏松間葉組織區(qū),外周致密區(qū)表達(dá)弱或不表達(dá)。
　　3.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的ERα主要表達(dá)于細(xì)胞核中,睪丸下降第一階段

10、較第二階段前表達(dá)逐漸增加,第二階段后表達(dá)逐漸減弱。
　　4.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的ERβ表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,在睪丸下降的第一階段其表達(dá)逐漸增加,第二階段也有表達(dá)但無差異性(其蛋白定量研究尚需進(jìn)一步確定)。
　　5.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的GPER主要表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。睪丸下降第一階段表達(dá)量逐漸增加,第二階段逐漸減弱。
　　綜上,本實(shí)驗(yàn)研究提示不同發(fā)育時(shí)期的小鼠睪丸引帶組織均有E