睪丸引帶發(fā)育過程中雌激素受體的表達.pdf

1、背景與目的：雌激素與男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切。近年來研究表明，雌激素異常，包括外源性雌激素（EEs）的影響與日益增加的男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育異常/畸形密切相關(guān)。究其機理，除了經(jīng)典的雌激素核受體ERα、ERβ外，新近發(fā)現(xiàn)的功能性膜性受體G蛋白偶聯(lián)的雌激素受體（GPER）也很可能在其中發(fā)揮著不可忽視的重要作用。GPER已被證實廣泛存在于雄性泌尿生殖系統(tǒng)，包括睪丸、附睪、輸精管、精囊以及前列腺等雄性生殖器官。提示雌激素與相關(guān)受體的作用通路可

2、能是研究EEs致畸機制的關(guān)鍵。睪丸在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育中的地位特殊，已有很多關(guān)于雌激素以及EEs直接影響睪丸發(fā)育的研究。在胚胎期，睪丸的正常發(fā)育需伴隨其自身的下降，睪丸的下降又與睪丸引帶（Gubernaculum）發(fā)育關(guān)系密切。因此從睪丸引帶角度研究EEs對睪丸乃至整個雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響是一條新的途徑。本實驗通過組織免疫熒光、實時熒光定量PCR方法研究ERα、ERβ及GPER在小鼠睪丸引帶發(fā)育過程中不同時間點蛋白和基因的表達情況，以了

3、解三種雌激素受體在睪丸引帶上的表達情況，為進一步探討雌激素通過睪丸引帶途徑影響睪丸下降甚至雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的機理研究提供基礎。
　　材料與方法：8～10周齡SPF級昆明小鼠105只，按雌雄比例2:1合籠交配，以檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓作為受孕標志。發(fā)現(xiàn)陰道栓當天定為妊娠0天，記為GD0（GD），胎鼠組分別于GD17，GD19天取材。幼鼠組待其自然分娩，以幼鼠出生當天定為生后0天，記為PD0（PD），分別于PD0、PD3、PD7、PD14、P

4、D21取材。
　　1.取上述不同生長發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶，予固定、石蠟包埋。對包埋組織塊作2μm厚冠狀位切片并進行組織免疫熒光染色研究，檢測睪丸引帶上三種雌激素受體蛋白的表達情況（定性、定位）。
　　2.取上述不同生長發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶，用 Trizol法提取引帶組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法鑒定 RNA完整性及純度，利用實時熒光定量PCR檢測睪丸引帶上三種雌激素受體基因的表達情況（定量）。
　　結(jié)

5、果：
　　1.組織免疫熒光染色：隨著胎/小鼠天齡的增加，可見ERα、ERβ及GPER蛋白表達于不同生長發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶。①ERα嚴格表達于細胞核中，主要表達于小鼠睪丸引帶外周致密的細胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達量弱。②ERβ表達于細胞核和細胞質(zhì)中，在出生前表達于小鼠睪丸引帶內(nèi)層疏松的間葉組織和外周致密的細胞區(qū)中，出生后主要表達于外周致密的細胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達量弱或不表達。③GPER表達于細胞膜和細胞質(zhì)中，主要表

6、達于小鼠睪丸引帶外周致密的細胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達量弱或不表達。
　　2、實時熒光定量PCR檢測：隨著胎/小鼠天齡的增加，均可檢測到ERα、ERβ及GPER基因的表達，表達不一。統(tǒng)計學分析結(jié)果如下：①ERαmRNA表達于睪丸下降的不同階段，與出生當天（PD0）相比較，孕期表達無差異性，出生后其表達量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。② ERβmRNA表達于睪丸下降的不同階段，與出生當天（PD0）相比較，孕期表達無差異性，出生后其表達量呈

7、現(xiàn)逐漸下降的趨勢。③GPER mRNA表達于睪丸下降的不同階段，與出生當天（PD0）相比較，孕期至睪丸下降第二階段（PD7）開始時表達無差異性，第二階段開始后其表達量逐漸減弱。
　　結(jié)論：
　　1.正常小鼠睪丸引帶組織發(fā)育過程中均可檢測到ERα、ERβ及GPER蛋白及基因的表達。
　　2.免疫熒光確認ERα在睪丸引帶細胞核上表達，ERβ在細胞核和細胞質(zhì)表達，GPER在細胞膜和細胞質(zhì)表達，且三者主要表達于睪丸引帶外周致密

8、的細胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達量弱或不表達。
　　3.睪丸引帶組織中ERα, ERβmRNA出生后表達量逐漸下降，GPER mRNA在睪丸下降第二階段開始后表達量逐漸下降。
　　4.在介導睪丸下降的過程中，ERα、ERβ和GPER可能發(fā)生的作用不盡相同。
　　綜上所述，本實驗研究提示不同生長發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶組織均可見ERα、ERβ、GPER的表達。這三種受體的表達呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，提示雌激素（包括外源性雌激素