植物多酚拮抗高鹽升壓作用及保護靶器官的機制研究.pdf

1、背景:
　　我國正邁入老齡化社會，高血壓是最常見的老年慢性病之一，也是心腦血管病最主要的危險因素。近百年來人們圍繞鹽與血壓的關(guān)系進行研究，基本上確定了鹽是高血壓的重要易患因素。但在人群內(nèi)個體間對鹽負(fù)荷或限鹽卻呈現(xiàn)不同的血壓反應(yīng)，即存在鹽敏感性問題。腎臟生理功能異常是誘發(fā)及維持高血壓的重要因素，而高血壓又可成為慢性腎損害的病因，兩者相互影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激參與高血壓、腎臟受損、老齡化血管功能障礙等多種心腎血管疾病的

2、發(fā)生發(fā)展。其中，內(nèi)皮功能損傷和高血壓特別是鹽敏感性高血壓的發(fā)病機制密切相關(guān)。流行病學(xué)研究表明，多種膳食因素可影響血壓和血管功能，在過去的十余年中，通過減少鈉鹽的攝入、增加鉀鹽的攝入和增加以蔬菜和水果為基礎(chǔ)的“清淡飲食”的攝入，可有效的降低血壓和改善血管功能。其中，膳食植物多酚廣泛分布于各種水果、蔬菜、谷物中，其對健康的影響受到人們越來越多的關(guān)注。芹菜素和姜黃素是兩種重要的植物多酚，既往研究發(fā)現(xiàn)芹菜素和姜黃素具有降壓、擴血管、抗氧化等作用

3、，但具體機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)激活過氧化物酶體增殖物激活受體δ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorδ，PPARδ)產(chǎn)生的非基因作用可通過磷酯酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threoninekinase/endothelialnitricoxidesynthase,PI3K/Akt-eNOS)

4、信號通路改善內(nèi)皮依賴性血管功能障礙，而芹菜素可激活PPARγ發(fā)揮抗炎作用;研究表明，姜黃素可以調(diào)節(jié)老齡小鼠的血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的5'-AMP激活的蛋白激酶(5'-AMP-activatedproteinkinase，AMPK)信號通路。因此我們推測，芹菜素可能通過上調(diào)PPARδ激活PI3K/Akt-eNOS，促進內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(nitricoxide，NO)的生成，改善血管功能、預(yù)防鹽敏感性高血壓和保護腎臟;姜黃素可通過激活A(yù)MPK

5、、上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2(uncouplingprotein2，UCP2)，減少活性氧簇(oxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生，改善老齡化相關(guān)的腦血管功能障礙。
　　目的:
　　為了驗證上述假設(shè)，本研究分為三部分進行。第一部分研究膳食芹菜素對醋酸脫氧皮質(zhì)酮-鹽(deoxycorticosteroneacetate-salt，DOCA-鹽)高血壓大鼠是否具有降壓作用和改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能作用，芹菜素對DOCA-鹽高血壓大

6、鼠24小時尿蛋白、腎小球硬化的影響。第二部分觀察芹菜素對DOCA-鹽高血壓大鼠腎內(nèi)動脈內(nèi)皮ROS和NO水平、PPARδ-PI3K/Akt-eNOS通路信號分子蛋白表達(dá)的影響，應(yīng)用芹菜素與SD大鼠腎內(nèi)動脈孵育12小時，觀察芹菜素是否通過PPARδ-PI3K/Akt-eNOS發(fā)揮改善血管功能和抗氧化應(yīng)激作用。第三部分通過體內(nèi)和體外實驗，明確姜黃素是否通過激活A(yù)MPK/UCP2信號通路減少老齡鼠的腦血管ROS的產(chǎn)生和增加NO的生成，從而改善老

7、化腦血管功能障礙。
　　材料與方法:
　　整個研究由在體實驗和離體實驗兩部分組成。在體試驗采用了多種動物模型。首先以DOCA-鹽高血壓大鼠作為鹽敏感性高血壓模型，按照是否注射DOCA造高血壓模型和是否喂食芹菜素飼料4周，分為對照組、芹菜素組、DOCA組、DOCA+芹菜素組。選取24個月的SD大鼠、UCP-/-小鼠和對照鼠作為老齡鼠，分別喂食普通飼料和姜黃素飼料，選取6個月齡大鼠喂食普通飼料被用來作為青齡大鼠對照組。離體實驗選

8、以SD大鼠腎內(nèi)動脈、SD大鼠和UCP2-/-小鼠腦動脈以及培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象。
　　1.無創(chuàng)鼠尾血壓儀測大鼠鼠尾血壓、多通道生理檢測儀記錄大鼠平均頸動脈壓。
　　2.組織冰凍切片HE染色觀察大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)變化。
　　3.小動物代謝籠收集大鼠24小時尿液，γ放射免疫法檢測尿蛋白含量，全自動生化檢測儀檢測尿電解質(zhì)。
　　4.小血管張力測定技術(shù)檢測芹菜素急性刺激后或長期干預(yù)后大鼠腎內(nèi)動脈舒張功能;姜黃素急性刺激

9、后或長期干預(yù)后鼠腦基底動脈舒張功能。
　　5.熒光顯像技術(shù)檢測芹菜素長期干預(yù)后對大鼠腎內(nèi)動脈ROS和NO水平的影響;姜黃素長期干預(yù)后對老齡鼠腦動脈ROS和NO水平影響。
　　6.蛋白免疫印跡法檢測芹菜素對大鼠腎內(nèi)動脈NO合成相關(guān)信號分子(PPARδ、p-Akt、Akt、eNOS、p-eNOS)的蛋白表達(dá);姜黃素對老齡鼠腦動脈和內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生相關(guān)通路(AMPK、UCP2)的蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.膳食芹

10、菜素降低DOCA-鹽高血壓大鼠鼠尾血壓和平均頸動脈壓，改善DOCA-鹽高血壓大鼠腎內(nèi)動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，減輕DOCA-鹽高血壓大鼠蛋白尿、腎小球硬化程度。
　　2.膳食芹菜素降低DOCA-鹽高血壓大鼠腎內(nèi)動脈ROS水平、增加NO合成和磷酸化eNOS蛋白表達(dá)。
　　3.芹菜素呈濃度依賴地內(nèi)皮依賴性舒張大鼠腎內(nèi)動脈，去除內(nèi)皮、應(yīng)用eNOS抑制劑、PPARδ抑制劑或PI3K抑制劑明顯削弱血管的舒張反應(yīng)。
　　4.膳食芹菜

11、素可顯著上調(diào)DOCA-鹽高血壓大鼠腎內(nèi)動脈PPARδ、磷酸化Akt蛋白表達(dá);芹菜素孵育SD大鼠腎內(nèi)動脈12小時可顯著上調(diào)大鼠腎內(nèi)動脈PPARδ、磷酸化Akt蛋白表達(dá)，加入PPARδ抑制劑或PI3K抑制劑可消除芹菜素對PPARδ、磷酸化Akt和磷酸化eNOS影響。
　　5.膳食姜黃素干預(yù)改善老齡大鼠腦基底動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，減少老齡大鼠腦血管ROS產(chǎn)生和增加eNOS磷酸化水平;膳食姜黃素通過UCP2依賴的方式減少老齡小鼠腦血

12、管ROS產(chǎn)生和改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。
　　6.膳食姜黃素上調(diào)老齡大鼠腦血管AMPK和UCP2蛋白表達(dá);姜黃素與老齡大鼠腦血管或動脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育12小時后可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞AMPK、UCP2和磷酸化eNOS蛋白表達(dá)，改善血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能或降低內(nèi)皮細(xì)胞ROS和增加NO水平，AMPK抑制劑和UCP2抑制劑可分別顯著減弱姜黃素的作用。
　　結(jié)論:
　　1.芹菜素降低DOCA-鹽高血壓大鼠血壓、改善內(nèi)皮依賴性血管舒張