TAK1siRNA對(duì)RA患者滑膜細(xì)胞中mmp9和timp1表達(dá)的影響.pdf

1、前言：
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱性關(guān)節(jié)骨、軟骨破壞為主要特征。RA的發(fā)病率在我國(guó)約為0.4%,其第一個(gè)5年致殘率達(dá)30%,平均縮短壽命5～7年,已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)RA滑膜細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)揮主要的作用,特別是分泌一些細(xì)胞因子像IL-1,TNF-α,聚蛋白多糖酶等誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和關(guān)節(jié)軟骨的破壞。而且這些

2、炎性因子之間相互作用,呈級(jí)聯(lián)放大作用,促成關(guān)節(jié)炎癥的不斷加重。所以尋求一種良好的治療方法成為現(xiàn)在學(xué)者研究的焦點(diǎn)。
　　 生長(zhǎng)因子蛋白激活激酶(TAK1)屬于MAPKKK家族,能被多種細(xì)胞因子包括IL-1β,IL-18,TNF-α等激活。細(xì)胞因子與膜受體結(jié)合后,通過(guò)TAK1磷酸化并激活MAP2Ks家族的MEK3/6和MEK4/7,隨后MEK3/6和MEK4/7分別激活MAPK家族的P38激酶、應(yīng)激活化激酶(JNK)進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子

3、激活蛋白1(AP-1)。此外TAK1還能激活I(lǐng)KK,從而使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中,參與基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB能上調(diào)多種RA發(fā)病中的重要基因產(chǎn)物表答,如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、環(huán)氧化酶2(COX-2)和多種細(xì)胞因子。其中MMPs可導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞;COX-2增加前列腺素生成,導(dǎo)致疼痛和持續(xù)滑膜炎癥;細(xì)胞因子刺激周?chē)幕ぜ?xì)胞產(chǎn)生更多的炎性因子,形成正反饋機(jī)制使RA病情不斷持續(xù)和進(jìn)展。目前已有研究表明在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中T

4、AK1大規(guī)模的表達(dá),并且阻遏TAK1基因可以使其下游炎性因子表達(dá)減少。我們所作的前期工作已經(jīng)證實(shí)了TAK1在RA病人滑膜中有較高水平的表達(dá)和活性,因此推斷TAK1可能在RA發(fā)病中起重要作用,阻斷TAK1將有助于降低致炎性細(xì)胞因子對(duì)RA關(guān)節(jié)和滑膜的影響,TAK1可以作為RA基因治療中的一種新的靶基因。
　　 金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)是MMP的特異性抑制劑,在ECM代謝調(diào)節(jié)中是與MMP對(duì)應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑。主要由氨基末端和羧基末端

5、結(jié)構(gòu)域來(lái)維持自身的穩(wěn)定性,目前已明確的TIMP主要有四種即TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1能抑制絕大多數(shù)MMP可與MMP9前體及有活性的MMP1、3、9形成高度親和的、非共價(jià)鍵結(jié)合的復(fù)合物。TIMP在組織中的主要作用是調(diào)節(jié)蛋白水解和抗水解作用之間的平衡,進(jìn)而維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性。MMP與TIMP之間維持一種平衡的關(guān)系,一旦這種關(guān)系被打破就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分解和組織結(jié)構(gòu)的重朔。TIMP1與TIMP家族中其他

6、的成員不同,并沒(méi)有明確的特異性。它既可以抑制大多數(shù)MMP酶類,也可以抑制人金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白(ADAMTS)像ADAMTS-4和ADAMTS-5。目前已有研究證實(shí)重組的人TIMP1可以明顯抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5,這種抑制作用甚至強(qiáng)于對(duì)MMP的抑制。TIMP1可以在發(fā)育的胚胎細(xì)胞、正常的人軟骨和滑膜細(xì)胞中表達(dá),在關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中表達(dá)會(huì)上調(diào)。另外在體外培養(yǎng)的滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中可被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子上調(diào)。IL-1也可更

7、進(jìn)一步放大TIMP1的分泌。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是關(guān)節(jié)軟骨中降解聚蛋白多糖和膠原的主要酶類,MMPs是在聚蛋白多糖核心蛋白的球間區(qū)(IGD)Asn3412Phe342位點(diǎn)裂解聚蛋白多糖,產(chǎn)生的聚蛋白多糖片段分別為G12DIPEN和FFG。MMP家族在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的軟骨、滑液、滑膜均有明顯的增高趨勢(shì),它主要通過(guò)炎性通路被上游的介質(zhì)激活。大量的研究證實(shí)MMP在RA的診斷中具有重要的意義。MMP與TIMP之間維持一種平衡的

8、關(guān)系,特別是TIMP1與MMP9特異結(jié)合,抑制后者的降解作用。同時(shí)又受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶的調(diào)節(jié),TAK1激活JNK誘發(fā)MMP1基因表達(dá)導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶,其可降解關(guān)節(jié)骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的基質(zhì)大分子,從而促進(jìn)血管翳對(duì)軟骨的侵蝕。故而滑膜中的成纖維樣細(xì)胞來(lái)源的MMPs是導(dǎo)致關(guān)節(jié)病理?yè)p傷的重要因素。并有報(bào)道滑膜的過(guò)度生長(zhǎng)引發(fā)致炎細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。正?；け桓布?xì)胞、RA患者滑膜A型細(xì)

9、胞基本上不能合成或很少合成MMPs,在RA過(guò)程中,增生的B型滑膜細(xì)胞可能在巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子刺激下,持續(xù)合成和分泌酶原形式的MMP-3。在血漿激肽釋放酶、纖溶酶或組織蛋白酶G等的作用下,轉(zhuǎn)化為具有活性的MMP-3,并激活滑膜被覆細(xì)胞分泌的膠原蛋白酶原,進(jìn)而引發(fā)MMPs家族其他成員活化。Gravallese利用原位雜交測(cè)定MMPs的RNA,發(fā)現(xiàn)MMP-3在滑膜組織中過(guò)度表達(dá),且滑液中含有大量MMP-3;另外,對(duì)R

10、A患者滑液中蛋白多糖、核心蛋白的分析表明,他們?cè)谠槐籑MP-3所清除。1987年Okada研究發(fā)現(xiàn),RA患者的關(guān)節(jié)液中MMP-1,MMP-2,MMP-3顯著增高,對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)有明顯破壞作用,早期RA血清中MMP-1,MMP-2的表達(dá)水平與疾病的活動(dòng)性和預(yù)期的功能損害及X線表現(xiàn)呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)307例臨床患者研究發(fā)現(xiàn),患者關(guān)節(jié)液中MMP-3濃度顯著增高可以作為RA的早期診斷和治療觀察指標(biāo)之一,尤其在血清陰性患者中適合?；蜓芯堪l(fā)現(xiàn),MMP

11、-3的基因多態(tài)性與RA的嚴(yán)重性相關(guān),而不是與RA是否發(fā)生相關(guān),研究這種多態(tài)性有助于早期預(yù)見(jiàn)RA的嚴(yán)重程度。雖然發(fā)現(xiàn)血清MMPs水平與疾病的活動(dòng)相關(guān),但在疾病開(kāi)始的時(shí)候血清pro-MMP-3高水平表達(dá)預(yù)示疾病的進(jìn)展可能比較嚴(yán)重。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、11例滑膜組織標(biāo)本來(lái)源于2009年11月-2010年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科住院患者。所有患者診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年

12、提出的診斷標(biāo)準(zhǔn),術(shù)前均經(jīng)倫理學(xué)認(rèn)證。RA患者男4例,女7例,年齡50-64歲,平均(56.2歲)。
　　 2、免疫組化染色試劑盒
　　 3、Real-timePCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒
　　 4、DharmaFECTsiRNA轉(zhuǎn)染試劑盒
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 RA患者滑膜細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞單層生長(zhǎng)達(dá)80-85%培養(yǎng)面積

13、后,用于實(shí)驗(yàn)或傳代。
　　 2、細(xì)胞鑒定
　　 將培養(yǎng)至三代的滑膜細(xì)胞做免疫組化鑒定,取出貼滿細(xì)胞的蓋玻片,10%甲醛溶液固定30min。晾干后PBS沖洗三次,加入3%H2O25-10min,PBS沖洗后,加入正常善養(yǎng)血清,室溫靜置10-15min,傾去、勿洗、甩干,加一抗過(guò)夜。滴加辣根過(guò)氧化物酶,室溫孵育10min,PBS沖洗3×3min,DAB顯色。顯色完全后復(fù)染、脫水、封片。
　　 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　

14、 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滑膜細(xì)胞種植于六孔板中,種板濃度3*105/孔。從六孔板中移除培養(yǎng)基,隨機(jī)將培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞分為陰性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)規(guī)定,每孔加入2mL配制好的FECT(含特異性siRNA)轉(zhuǎn)染液,培養(yǎng)細(xì)胞37C°、5%CO2孵箱中24h,用于mRNA分析。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
　　 提取RNA前半小時(shí)加入IL-1β置于孵箱中反應(yīng)。吸盡6孔板中的轉(zhuǎn)染液,加入1mLTrizol,室溫靜置5m

15、in。氯仿0.2mL/mLTrizol,1000轉(zhuǎn)離心15min,將水相移入新管。異丙醇沉淀RNA,清洗完畢后加入反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)。PCR反應(yīng)總體積25μL,其中SYBRPremixEx.TaqTM2×12.5μL、上、下游引物各0.5μL,三蒸水9.5μL,模板2μL。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,計(jì)量資料描述用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

16、
　　 TAK1siRNA對(duì)RA患者滑膜細(xì)胞中mmp9和timp1表達(dá)的影響。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)高效抑制TAK1在RA滑膜細(xì)胞中的表達(dá),real-timePCR發(fā)現(xiàn)timp1和romp9的表達(dá)不同程度的降低。兩者之間的下調(diào)比例存在明顯的不匹配關(guān)系。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)在RA患者滑膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TAK1siRNA后可抑制MMP9的表達(dá)。
　　 2、通