葡萄球菌耐甲氧西林的調控機制及快速檢測葡萄球菌的研究.pdf

1、目的：1.了解臨床分離的耐甲氧西林葡萄球菌攜帶的mecR1和mecI基因的突變缺失情況,并比較這種突變缺失情況在金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中的差別. 2.mecR1和mecI基因的突變缺失對mecA基因表達和甲氧西林耐藥表型的影響. 3.建立應用實時熒光RT-PCR檢測mecA基因表達的方法,并探討mecA基因的表達水平與甲氧西林耐藥水平的關系. 4.建立應用普通PCR和免疫捕獲PCR檢測陽性血培養(yǎng)瓶中葡

2、萄球菌的方法. 方法：1.以PCR法檢測臨床分離的葡萄球菌是否攜帶mecA基因,以苯唑西林瓊脂稀釋法測定各菌株的苯唑西林MIC值. 2.以特異引物分別擴增mecR1基因的兩個重要功能區(qū)MS區(qū)和PB區(qū)來檢測mecR1基因的存在和缺失情況;以特異引物擴增mecI基因來檢測其存在和缺失情況,并對完整的mecI基因測序來觀察其突變情況. 3.根據NCBI上提交的mecA基因和16SrRNA基因序列設計特異引物,以實時熒光

3、RT-PCR相對定量的方法檢測mecA基因表達. 4.普通PCR.檢測陽性血培養(yǎng)瓶中的葡萄球菌采用3對引物:第一對引物用來檢測16SrRNA基因以確定是否為葡萄球菌,第二對引物用來檢測ssa基因以確定是否為金黃色葡萄球菌,第三對引物用來檢測mecA基因以確定是否為耐甲氧西林葡萄球菌. 5.免疫捕獲PCR法檢測金黃色葡萄球菌的方法如下:先以人IgG包被PCR管捕獲陽性血培養(yǎng)瓶中的金黃色葡萄球菌,然后檢測ssa基因加以確認,

4、最后檢測mecA基因以確定是否為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌. 6.以常規(guī)方法為"金標準",評價普通PCR法和免疫捕獲PCR法檢測葡萄球菌的靈敏度和特異度. 結果：1.在收集到的葡萄球菌中,有155株攜帶mecA基因,其中金黃色葡萄球菌60株、表皮葡萄球菌58株和溶血葡萄球菌37株.兩對引物檢測金黃色葡萄球菌中攜帶的mecA基因的結果相同,但在兩種凝固酶陰性的葡萄球菌中,兩對引物檢測mecA基因的結果有所不同,在6株表皮葡萄

5、球菌和4株溶血葡萄球菌中,以引物mecA2-F、mecA2-R檢測到mecA基因但以引物mecA1-F、mecA1-R未檢測到. 2.瓊脂稀釋法檢測苯唑西林MIC的結果顯示:在60株攜帶mecA基因的金黃色葡萄球菌中,有58株的苯唑西林MIC值≥4μg/ml,但有2株的苯唑西林MIC值僅為1μg/ml和2μg/ml;95株攜帶mecA基因的凝固酶陰性葡萄球菌的苯唑西林MIC值≥1μg/ml. 3.mecR1基因的檢測結果

6、顯示:三種葡萄球菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌)攜帶的mecR1基因MS區(qū)的百分率分別為83.3﹪、63.8﹪和16.2﹪,經X<'2>檢驗三種葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率有差別(X<'2>=43.513,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=42.249,P<0.001),表皮葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>

7、=20.638,P<0.001),但尚不能認為金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌在攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率有差別(X<'2>=5.814,P=0.016).三種葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率分別為71.7﹪、27.6﹪和5.4﹪,經X<'2>檢驗三種葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率有差別(X<'2>=47.481,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于表皮葡萄球菌(X<'2>=22

8、.922,P<0.001),表皮葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=7.237,P=0.007),金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=40.404,P<0.001).綜合MS區(qū)和PB區(qū)的檢測結果,經X<'2>檢驗,三種葡萄球菌攜帶完整mecR1基因在總體上有差別(X<'2>=49.291,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶完整mecR1基因的百分率要高于

9、表皮葡萄球菌(X<'2>=26.836,P<0.001),金黃色葡萄球菌攜帶完整.mecR1基因的百分率也高于溶血葡萄球菌(X<'2>=38.529,P<0.001),但尚不能認為表皮葡萄球菌與溶血葡萄球菌攜帶完整mecR1基因的百分率有差別(X<'2>=4.915,P=0.027>0.0125). 4.mecl基因的檢測結果顯示:在155株葡萄球菌中,mecl基因突變缺失情況十分常見,攜帶野生型mecl基因的僅有14株(9﹪)

10、.共檢測到mecI基因的突變位點4個,分別為43位點(G→T)、163位點(A→T)、202位點(C→T)和343位點(G→T),其中以202位點最為常見,有36株(占83.7﹪):52株葡萄球菌攜帶的mecI基因中有兩種不同長度的不完整ISll82片段插入;有46株葡萄球菌的mecl基因缺失. 5.實時熒光PCR相對定量檢測60株葡萄球菌中mecA基因的表達后分析顯示,meca基因的表達與葡萄球菌對甲氧西林的耐藥水平并無直接相

11、關性. 6.在493例血培養(yǎng)陽性報警瓶中,用常規(guī)方法檢測到葡萄球菌214株,其中有MRS172株;用普通PCR法共檢測到金黃色葡萄球菌22株和凝固酶陰性葡萄球菌189株,其中MRSA10株、MRCNS134株;免疫捕獲PCR法共檢測到金黃色葡萄球菌22株,其中MRSA 10株.以常規(guī)方法為"金標準",普通PCR法檢測葡萄球菌的的靈敏度為98.6﹪,特異度為100﹪;免疫捕獲PCR法檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度和特異度均為100﹪.

12、 結論：1.在臨床分離的金黃色葡萄球菌中,誘導基因mecR1可能是mecA基因表達的主要誘導因素;在臨床分離的凝固酶陰性葡萄球菌中,由于誘導基因mecR1缺失嚴重,mecA基因表達的誘導則可能主要來自mecR1基因以外的因素. 2.在臨床分離的耐甲氧西林葡萄球菌中,mecI基因的缺失突變可能是造成mecA基因表達的重要原因,但攜帶野生型mecI基因的菌株仍能表達pbp2a說明在某些葡萄球菌甚至在整個葡萄球菌中可能存在一種