兩種酸性耐熱α-淀粉酶的表達研究.pdf

1、α-淀粉酶(1，4-α-D-葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)能夠以淀粉為底物，從淀粉內(nèi)部水解1，4-α-D-葡萄糖苷鍵，廣泛應(yīng)用在淀粉糖生產(chǎn)、發(fā)酵、紡織、造紙等許多行業(yè)，具有巨大的經(jīng)濟價值。本研究嘗試?yán)冒退沟庐叧嘟湍窹ichiapastoris作為生物反應(yīng)器表達兩種極具應(yīng)用潛力的極端α-淀粉酶，并研究了重組α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)。 從嗜酸耐熱的酸熱脂環(huán)酸桿菌Alicyclobacillusacidocaldarius

2、中克隆到一種α-淀粉酶的基因amy，基因amy全長3903bp，編碼1301個氨基酸，理論分子量約140kD?；騛my被分別克隆到質(zhì)粒表達載體pET-22b(+)和pPIC9α，并分別在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)和巴斯德畢赤酵母P.pastorisGS115中得到表達，表達產(chǎn)物具有淀粉酶的活性。 純化酵母中表達的重組α-淀粉酶rAMY，并研究了它的酶學(xué)性質(zhì)。以可溶性淀粉為底物，rAMY作用最適pH

3、3.2，在pH2.5-4.6范圍內(nèi)，酶活性保留50％以上，它的最適溫度65℃，在70℃下處理30分鐘，酶活性維持50％以上。重組α-淀粉酶rAMY基本保留了天然酶蛋白的耐熱性和嗜酸性特點。 根據(jù)對α-淀粉酶AMY的氨基酸序列分析和同源建模，去除基因amy的+1～+1174bp和+3288～3903bp的核酸序列，獲得全長2115bp的基因片斷amy'，amy'編碼705個氨基酸，理論分子量約79kD。amy'被克隆到質(zhì)粒表達載體

4、pET-22b(+)，并在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)獲得表達，表達產(chǎn)物具有淀粉酶的活性，證明該截斷肽鏈包含能折疊形成α-淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域所需的氨基酸序列。 來源于嗜熱球菌Thermococcussp.的酸性高溫α-淀粉酶BD5063理論分子量約49kD，不存在潛在N-連接糖基化位點，編碼基因BD5063全長1299bp。根據(jù)巴斯德畢赤酵母高效表達基因的密碼子使用偏好性，對BD5063進行密碼子優(yōu)化并全基因合成獲得新基

5、因BD5063r。巴斯德畢赤酵母能高效表達基因BD5063r，表達量達到60mg/L，表達產(chǎn)物rBD5063水解可溶性淀粉主要產(chǎn)物是單糖和低聚寡糖，結(jié)合活性染色結(jié)果證明rBD5063具有α-淀粉酶的活性。 純化rBD5063，獲得純度大于90％的樣品，并研究了rBD5063酶學(xué)性質(zhì)。以可溶性淀粉為底物，rBD5063作用最適pH5.0,在pH3.5～10.0范圍內(nèi)處理30分鐘，酶活性保留50％以上；作用最適溫度100-110℃，

6、在90℃下酶活性半衰期約30分鐘。低濃度Ca2+對激活rBD5063活性和維持穩(wěn)定性是必需的，而且在一定濃度范圍內(nèi)Ca2+濃度對活性影響不顯著，Mg2+、SDS和TritionX-100都能夠部分抑制rBD5063活性，Cu2+和EDTA嚴(yán)重抑制rBD5063活性。 研究了rBD5063的多組分情況，表達產(chǎn)物包括三種分子量分別是64、57、44kD的活性組分，在通常情況下主要以大分子量活性多聚體的形式存在。rBD5063不存在N