bacillussp.yx1中溫酸性α淀粉酶的分離純化及基因克隆和表達的研究

1、江南大學(xué)博士學(xué)位論文Bacillus sp.YX-1中溫酸性α-淀粉酶的分離純化及基因克隆和表達的研究姓名：劉旭東申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：徐巖20080901江南大學(xué)博士學(xué)位論文同源性設(shè)計引物，擴增獲得B a c i l l u ss p ．Y X ．1Q ．淀粉酶的結(jié)構(gòu)基[ 司a m y 。該基因全長1 5 4 5b p ，編碼5 1 4 個氨基酸殘基。該基因已在G e n B a n k 數(shù)據(jù)庫登記，登記號為E U

2、 l 5 9 5 8 0 。將結(jié)構(gòu)基因全序列口聊) ，比對分析發(fā)現(xiàn)，B a c i l l u ss p ．Y X ．1 中溫Q - 淀粉酶與芽孢桿菌屬a - 淀粉酶表現(xiàn)出較高的同源性，然而，在表觀酶學(xué)性質(zhì)上B a c i l l u ss p ．Y X - 1 中溫0 【- 淀粉酶表現(xiàn)出較好的耐酸特性和較強的生淀粉底物水解能力。在研究中分別從酶蛋白氨基酸組成、維系酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的空間作用力以及酶蛋白結(jié)構(gòu)等多角度來闡述B a c i l l

3、 u ss p ．Y X 一1 中溫洳淀粉酶基因序列與其催化功能( 酸性條件下的活性和穩(wěn)定性) 之間的內(nèi)在聯(lián)系；并從基因序列角度初步分析了紫外誘變后突變菌株產(chǎn)酶能力提高的機理。將B a c i l l u ss p ．Y X ．1 中溫( I t ．淀粉酶結(jié)構(gòu)基因插入表達載體p E T 2 8 a 中并轉(zhuǎn)化相應(yīng)表達宿主Ec o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中成功構(gòu)建帶有目的基因的重組菌株E c o l i B L 2 1

4、 ( D E 3 )( p E T - 2 8 a ．a(chǎn) m y ) 。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度從3 7 ℃降低至3 0 。C 時，表達后形成的可溶性蛋白增加，并確定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度3 0 ℃，誘導(dǎo)物I P T G 濃度0 ．5m m o l ／L 。在以上誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，該重組菌粗酶液催化活性為1 ．5 2 U ／m g 。利用H i s - t a g 親和層析分離純化了表達后的重組蛋白。關(guān)鍵詞：B a c i l l u s s