穩(wěn)定表達(dá)鼠IFN-λ的CHO細(xì)胞系建立.pdf

1、目的：構(gòu)建鼠λ2-干擾素(mIFN—λ2)的pEGFP真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)分泌型mIFN—λ2蛋白的CHO細(xì)胞系，并在體外培養(yǎng)的細(xì)胞上檢測mIFN—λ2蛋白的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究IFN—λ家族的生物學(xué)功能及進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)抗肺癌治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：用人水皰口炎病毒(VSV)刺激小鼠脾臟細(xì)胞，用RT—PCR克隆mIFN—λ2全長基因，克隆至測序載體PMD18—T Vector進(jìn)行基因序列測定，將序

2、列測定正確的mIFN—λ2基因與pEGFP真核表達(dá)載體連接，構(gòu)建pEGFP—mIFN—λ2真核表達(dá)載體。將重組體轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，加入G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)mIFN—λ2蛋白的CHO細(xì)胞株，收集其分泌的上清在鼠肺癌細(xì)胞上進(jìn)行抗病毒活性測定。 結(jié)果：PMD18—T—mIFN—λ2，用XhoⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，出現(xiàn)582bp大小的帶，經(jīng)基因序列測定與Genebank上公布的mIFN—λ2的序列完全一致。成功構(gòu)建了pEGFP—mI

3、FN—λ2真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞篩選出穩(wěn)定表達(dá)mIFN—λ2的細(xì)胞株，RT—PCR檢測到CHO—pEGFP—mIFN—λ2細(xì)胞株中mIFN—λ2 mRNA的表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)mIFN—λ2的CHO細(xì)胞株所分泌的細(xì)胞上清中的mIFN—λ2蛋白在鼠肺癌細(xì)胞上的抗病毒活性為104 AU/ml。 結(jié)論：本研究成功克隆了mIFN—λ2的全長序列，并建立了穩(wěn)定表達(dá)mIFN—λ2的CHO細(xì)胞株，其所生產(chǎn)的分泌型mIFN—λ2蛋白在體外培