雞SelW過表達(dá)CHO-K1細(xì)胞系的構(gòu)建及其抗氧化功能的研究.pdf

1、硒是生物體生命活動的必需微量元素，其主要以硒蛋白的形式發(fā)揮生物學(xué)作用。硒蛋白W(SelW)是硒蛋白家族的一員，在多種動物的不同組織中均可表達(dá)，并且哺乳動物SelW可以作為一種氧化還原酶。目前關(guān)于SelW的研究主要集中于哺乳類動物，如靈長類和嚙齒類。禽類SelW除組織分布研究的較清楚外，其它知之甚少，尤其是雞SelW的體外表達(dá)方面的研究還未見報道，雞SelW的生物學(xué)作用也研究較少。
　　 本研究根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包含3'UTR

2、區(qū)域SECIS在內(nèi)的雞SelW真核細(xì)胞表達(dá)載體和綠色熒光蛋白重組表達(dá)載體。通過綠色熒光蛋白重組表達(dá)載體對細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化，將雞SelW真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)細(xì)胞中，采用RT-PCR和實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞SelW表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，同時還采用qPCR技術(shù)檢測了硒蛋白合成相關(guān)酶硒代半胱氨酸合成酶(SecS)和硒磷酸化物合成酶(SPS-1)mRNA水平。隨后以雞SelW過表達(dá)CHO

3、-K1細(xì)胞系和CHO-K1正常細(xì)胞為試驗對象，采用AO/EB雙染和TUNEL方法對不同濃度的過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，同時采用qPCR方法測定過表達(dá)細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中Caspase-3、Caspase-8和FasmRNA水平，結(jié)果表明：
　　 1根據(jù)已知雞SelW cDNA序列，我們設(shè)計了能夠克隆出雞SelW SECIS的引物，并成功構(gòu)建了雞SelW真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/SelW。
　　 2通過限

4、制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，我們成功將pEGFP-N1中的綠色熒光光蛋白基因連接到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建了重組綠色熒光蛋白表達(dá)載體pcDNA3.1/GFP。優(yōu)化轉(zhuǎn)染試驗中，轉(zhuǎn)染試劑和pcDNA3.1/GFP的比例為8:2(μL：μg)時轉(zhuǎn)染效率最高。
　　 3本實驗成功將雞SelW轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞中，最適條件是六孔板每孔加入8μL轉(zhuǎn)染試劑和2μg的表達(dá)載體。pcDNA3.1/SelW轉(zhuǎn)染24 h和48

5、 h后，對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SelW的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SelW的細(xì)胞中SelW、SecS和SPS-1 mRNA水平進(jìn)行檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SelW的細(xì)胞中出現(xiàn)了SelW特異性條帶，而未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SelW細(xì)胞中沒有此條帶的出現(xiàn)，同時qPCR顯示，轉(zhuǎn)染雞SelW細(xì)胞中的SelW mRNA水平明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，說明我們成功構(gòu)建了雞SelW過表達(dá)細(xì)胞系。我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染雞SelW細(xì)

6、胞的SecS mRNA水平明顯增高，SPS-1 mRNA水平無明顯變化，我們推測SecS參與了雞SelW的合成，而SPS-1沒有。
　　 4過氧化氫能夠誘導(dǎo)雞SelW過表達(dá)細(xì)胞系和正常細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。經(jīng)AO/EB雙染和TUNEL法檢測我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染雞SelW細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯低于同水平的過氧化氫誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)同濃度過氧化氫誘導(dǎo)的