Sirt3在自發(fā)性高血壓大鼠心肌高表達(dá)與左心室肥厚相關(guān).pdf

1、研究目的
　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶3(sirtuin3，sirt3)為沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silentinformationregulator2，SIR2)家族成員之一，定位于線粒體內(nèi)膜，具有脫乙?；富钚?。人們發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白參與調(diào)控了許多細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞壽命等。Sirt3增加表達(dá)與延長(zhǎng)人類的壽命有關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中在它與心血管疾病的關(guān)系上。目前，對(duì)于sirt3與高血壓所致左

2、心室肥厚的關(guān)系尚不明確。本研究旨在觀察sirt3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌中的表達(dá)，并探討sirt3在高血壓所致左心室肥厚(leftventricularhypertrophy，LVH)中的作用。
　　 方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)
　　 選擇29周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)26只，隨機(jī)分為SHR30周組（喂養(yǎng)1周）和SHR38周組（喂養(yǎng)9周）;另選同齡Wistar—Kyoto(WKY)大鼠20只，隨機(jī)

3、分為WKY30周組（喂養(yǎng)1周）和WKY38周（喂養(yǎng)9周）作為正常對(duì)照。分批于30周及38周處死。各組測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓和左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVM/體質(zhì)量)。留取心尖（約1/2左心室）的部分，錫鉑紙包裹后液氮冷凍，-80℃冰箱保存已備做qRT-PCR及Western用。余1/2左心室組織經(jīng)過4％多聚甲醛固定48小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋以備用于免疫組織化學(xué)染色。
　　 2.超聲心動(dòng)圖測(cè)量
　　 PHILIPS公司IE33心臟超聲

4、儀，選S12-5超聲探頭，頻率約5MHz，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)，舒張末期左室后壁厚度(LVPWD)，舒張末期室間隔厚度(IVSD)，左室短軸縮短率(LVFS)以評(píng)價(jià)心臟的結(jié)構(gòu)和功能。
　　 3.Masson染色
　　 切片常規(guī)脫蠟至水，Masson三色染色試劑盒進(jìn)行染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。并采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量心肌組織膠

5、原容積積分(CVF)。CVF=膠原面積/總面積（其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積）。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色
　　 取組織切片，進(jìn)行sirt3的免疫組織化學(xué)染色，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取5張切片，隨機(jī)分析3個(gè)視野，圖像采用Image-ProExpress6.0軟件分析蛋白表達(dá)量，結(jié)果以累積光密度值表示。
　　 5.Westernblot法顯示組織中蛋白的表達(dá)
　　 將-80℃保存的組織，先進(jìn)行總蛋白的提取，

6、然后用BCA法測(cè)定蛋白的濃度，再按常規(guī)方法配分離膠和濃縮膠，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗過夜、二抗孵育、曝光、顯影、定影，條帶用Image-ProExpress6.0軟件分析灰度值。
　　 6.實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)
　　 Trizol法提取總的RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA，用Premer5.0設(shè)計(jì)sirt3的特異引物，以GAPDH基因做內(nèi)參照，熒光定量PCR檢測(cè)sirt3的mRNA的相對(duì)表達(dá)。

7、　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，直線相關(guān)(Person相關(guān))分析用以研究?jī)勺兞恐g的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.實(shí)驗(yàn)中2只SHR大鼠死亡，均為SHR38周組，最終44只完成實(shí)驗(yàn)。其中SHR30周組11只，SHR38周組13只，對(duì)照組WKY大鼠2

8、0只。
　　 2.與WKY對(duì)照組大鼠比較，SHR組的收縮壓、LVM/體質(zhì)量、左室收縮末期內(nèi)徑、舒張末期室間隔厚度、舒張末期左室后壁厚度、CVF、sirt3mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高（均P＜0.05）;左室短軸縮短率、左室舒張末期內(nèi)徑均明顯降低（均P＜0.05)，SHR大鼠表現(xiàn)出明顯的左心室肥厚，左心室收縮及舒張功能明顯減低，隨著周齡的延長(zhǎng)，心肌肥厚及心功能障礙明顯加重(均P＜0.05)。
　　 3.把SHR心肌sirt