抑制脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2改善載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究.pdf

1、第一部分:慢病毒介導的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2RNA干擾抑制RAW264.7細胞炎癥基因表達的實驗研究
　　研究背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個復雜的多因素過程并與炎癥密切相關(guān)。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2,Lp-PLA2)是一個新型的AS危險因子和標志物，并可對斑塊不穩(wěn)定、破裂及未來的心血管事件起到預測作用。Lp-PLA2可以

2、通過水解氧化磷脂并生成具有強大生物學活性的溶血磷脂膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)和氧化非酯化脂肪酸(oxidizednon-esterifiedfattyacid，oxNEFA)，它們都在AS的形成及進展過程中起關(guān)鍵作用。抑制炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)可以在臨床上高效特異性地降低目標基因的表達。在本研究中，我們采用RNA干擾的方法來降低

3、小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7細胞)Lp-PLA2的表達，并通過ELISA和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(realtimepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基因表達變化。
　　目的
　　觀察氧化低密度脂蛋白(oxygenizedlowdensitylipoprotein，oxLDL)和Lp-PLA2RNA干擾對RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基

4、因活性及其mRNA表達的影響。
　　方法
　　我們構(gòu)建Lp-PLA2RNA干擾慢病毒或者陰性對照慢病毒(negativecontrol，NC)，滴度1×109TU(transductionunits)/ml;用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細胞。RAW264.7細胞經(jīng)oxLDL預處理后，Lp-PLA2活性及其mRNA表達明顯增加。在后續(xù)試驗中我們采用60μg/mloxLDL對細胞進行預處理因為60μ

5、g/ml時oxLDL作用已達平臺期。然后我們對RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染NC慢病毒或者不同的Lp-PLA2RNAi慢病毒載體（病毒感染復數(shù)=50）來確定沉默效率。我們應(yīng)用ELISA和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.在oxLDL預處理前RAW264.7細胞Lp-PLA2表達水平極低;oxLDL可明顯上調(diào)RAW264.7細胞Lp-PLA2活性及其mRNA表達，且其作用呈時間和劑量依賴

6、性。在oxLDL濃度遞增至60μg/ml時Lp-PLA2的表達已達平臺期。因此在后續(xù)實驗中我們采用60μg/mloxLDL對RAW264.7細胞進行預處理。
　　2.基因沉默分析顯示Lp-PLA2-siteA降低RAW264.7細胞Lp-PLA2表達最有效。
　　3.慢病毒介導的Lp-PLA2RNA干擾可明顯抑制oxLDL引起的RAW264.7細胞MCP-1、IL-6及MMP-8表達增高。
　　結(jié)論
　　慢病毒介

7、導的Lp-PLA2RNA干擾可明顯逆轉(zhuǎn)oxLDL刺激引起的RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基因高表達
　　第二部分:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2RNA干擾抑制載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究
　　研究背景
　　盡管目前我們對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的諸多傳統(tǒng)危險因子采取了強化治療方案，但許多病人依舊不能免于冠脈事件的初發(fā)及復發(fā)。AS是一個復雜的多因素過程并與炎癥有密切聯(lián)系。AS過

8、程中存在脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)過表達。Lp-PLA2可通過水解氧化磷脂生成具有強大生物學活性的溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸，它們都在AS進展過程中起關(guān)鍵作用。抑制炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑。已證實RNA干擾在抑制分裂細胞和非分裂細胞目的基因表達方面非常有效。在本研究中，我們構(gòu)建載脂蛋白E基因敲除小鼠(apolipoproteinE-

9、deficientmice，apoE-/-小鼠)AS模型，并采用RNA干擾技術(shù)來降低Lp-PLA2的表達，然后我們檢測了斑塊形態(tài)學和炎癥基因表達的變化并就此過程進行了深入的機制研究。
　　目的
　　驗證慢病毒介導的Lp-PLA2RNA干擾是否可以抑制apoE-/-小鼠AS形成。
　　方法
　　86只apoE-/-小鼠均喂養(yǎng)高脂飲食，并在它們的左頸總動脈上放置一個縮窄性硅膠套管來誘導AS斑塊形成。我們正中切開小鼠頸

10、部皮膚，小心分離皮下組織，分離頸部肌肉，暴露左頸總動脈，在頸總動脈上放置一個長3mm、內(nèi)徑0.3mm的縮窄性硅膠套管，并用三根絲線固定牢固。apoE-/-小鼠被隨機分為Lp-PLA2RNAi組、病毒陰性對照組(NC組)和對照組。然后我們構(gòu)建Lp-PLA2RNA干擾慢病毒或NC慢病毒載體，8周后對小鼠AS模型進行頸動脈斑塊慢病毒轉(zhuǎn)染，對照組應(yīng)用生理鹽水。七周后收集斑塊采用HE、油紅O和MASSON染色進行病理組織學檢查;并采用ELISA和

11、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)檢測血漿和斑塊局部Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.慢病毒轉(zhuǎn)染7周后，與對照組及NC組相比，Lp-PLA2RNAi組血漿Lp-PLA2濃度及斑塊局部Lp-PLA2mRNA表達水平均明顯降低;且Lp-PLA2RNAi組小鼠斑塊局部及全身炎癥基因表達水平均明顯降低。
　　2.Lp-PLA2RNA干擾也能明顯減輕斑塊進展，減輕斑塊面積，增加纖維帽厚度，并減少斑塊脂質(zhì)含量，增加斑

12、塊膠原含量，說明斑塊穩(wěn)定性增加。
　　3.Lp-PLA2RNA干擾對AS的有益作用是獨立于降脂作用之外的，因為我們發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2RNAi組、NC組和對照組組間總膽固醇和甘油三酯水平均無顯著性差異。
　　結(jié)論
　　我們的研究結(jié)果說明慢病毒介導的Lp-PLA2RNA干擾可減輕apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化并增加斑塊的穩(wěn)定性，且這種有益作用是獨立于降脂作用之外的。
　　第三部分:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抑制劑及RNA干

13、擾影響載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的對比研究
　　研究背景
　　盡管目前我們對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的治療取得了長足進展，但是許多表面健康的AS患者依然會發(fā)生猝死，甚至沒有任何前驅(qū)癥狀。這促使我們進一步尋找新的動脈粥樣硬化危險因子和治療靶點。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是一個新型的AS危險因子和標志物，AS

14、過程中存在Lp-PLA2過表達。目前Lp-PLA2的特異性抑制劑darapladib吸引了眾多人的關(guān)注。以往多項動物實驗表明darapladib可以減少斑塊內(nèi)LPC含量，抑制促AS炎癥基因表達，并減少斑塊壞死核心的形成。然而，在關(guān)于darapladib的Ⅱ期大型臨床試驗中，Lp-PLA2抑制劑darapladib并未改變?nèi)祟惞跔顒用}斑塊的體積。所以，實驗室和流行病學證據(jù)關(guān)于darapladib對AS的影響仍存在爭議。已證實RNA干擾在抑

15、制分裂細胞和非分裂細胞目的基因表達方面非常有效。在本研究中，我們采用兩種方法(darapladib和Lp-PLA2RNAi)抑制小鼠Lp-PLA2的表達，并觀察Lp-PLA2表達下降對AS及炎癥基因表達的影響，探討治療動脈粥樣硬化的新機制。
　　目的
　　Lp-PLA2在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程起重要作用，特別是在晚期斑塊中起重要作用。在本研究中，我們比較了darapladib（一種選擇性的Lp-PLA2抑制劑），與慢病毒介導

16、的Lp-PLA2RNA干擾對載脂蛋白E基因敲除小鼠AS模型的炎癥基因表達和動脈粥樣硬化的影響。
　　方法
　　96只apoE-/-小鼠均喂養(yǎng)高脂飲食，并在它們的左頸總動脈上放置一個縮窄性硅膠套管來誘導AS斑塊形成。我們正中切開小鼠頸部皮膚，小心分離皮下組織，分離頸部肌肉，暴露左頸總動脈，在頸總動脈上放置一個長3mm、內(nèi)徑0.3mm的縮窄性硅膠套管，并用三根絲線固定牢固。apoE-/-小鼠被隨機分為對照組、病毒陰性對照組（NC

17、組）、darapladib組和Lp-PLA2RNA干擾(Lp-PLA2RNAi)組。8周后，慢病毒介導的Lp-PLA2RNA干擾或darapladib被用來降低小鼠AS斑塊局部Lp-PLA2的表達。5周后收集斑塊采用HE、油紅O和MASSON染色進行病理組織學檢查。我們還在蛋白和mRNA水平檢測了AS斑塊局部Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.與非處理組小鼠（對照組+NC組）相比，處理組小鼠(darapl

18、adib組+Lp-PLA2RNAi)組）血漿促炎因子的表達顯著減少，而血漿抗炎因子的表達顯著增加。
　　2.此外，我們的研究結(jié)果表明處理組小鼠抑制Lp-PLA2表達后，AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著減少，而膠原含量顯著增加。有趣的是，當比較這兩種Lp-PLA2的抑制方法后，我們發(fā)現(xiàn)，與darapladib組相比，Lp-PLA2RNAi組小鼠斑塊面積減少和斑塊穩(wěn)定性的增加更顯著。單純Darapladib治療不能影響動脈粥樣硬化斑塊面積。