GPR48通過HB-EGF反式激活EGFR誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題組在之前的研究中已經(jīng)證明GPR48通過EGFR信號通路來調(diào)節(jié)眼瞼上皮細(xì)胞的增殖和遷移,進(jìn)而調(diào)控小鼠的眼瞼發(fā)育,但其具體分子機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)將在之前研究的基礎(chǔ)上,對GPR48通過EGFR通路調(diào)控上皮細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,進(jìn)一步探討GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的分子機(jī)制。
　　 方法:①在體外培養(yǎng)的Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮細(xì)胞中加入EGFR的特異性酪氨酸激酶抑制劑AG1478后,用We

2、stern blot檢測EGFR的磷酸化程度及其下游信號通路分子的活化情況；
　　 ②使用免疫共沉淀法富集Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中EGFR的配體分子,Western blot檢測這些配體的蛋白表達(dá)情況；
　　 ③采用免疫沉淀的方法分別剔除Gpr48+/+與Gpr48-/-小鼠原代上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中EGFR配體,并用該培養(yǎng)基培養(yǎng)Gpr48-/-細(xì)胞,應(yīng)用Western blot檢測E

3、GFR及其下游信號分子的磷酸化水平；
　　 ④加入外源性HB-EGF或其抑制劑CRM197作用細(xì)胞,應(yīng)用Western blot檢測EGFR的磷酸化及其下游信號通路分子的活化狀態(tài)；
　　 ⑤同時(shí)用體外BrdU和體外細(xì)胞劃痕兩種功能實(shí)驗(yàn)檢測上皮細(xì)胞的增殖與遷移能力以驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 結(jié)果:(1)加入AG1478抑制劑作用Gpr48+/+與Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞20min后,發(fā)現(xiàn)Gpr48+/+小鼠原代

4、上皮細(xì)胞中P-EGFR水平明顯下降。與此同時(shí),細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中,檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)AG1478處理后,Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞的增殖和遷移能力也受到了明顯的抑制；
　　 (2)Western blot檢測顯示ERK、STAT3磷酸化水平在Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞中明顯低于Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞,當(dāng)加入AG1478作用后,Gpr48+/+與Gpr48+/+細(xì)胞的ERK、STAT3磷酸化水平都被抑制,Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞

5、的抑制程度更強(qiáng)；
　　 (3)Western blot檢測Gpr48+/+和Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中EGFR配體的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)HB-EGF在Gpr48-/-小鼠原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的量明顯低于在Gpr48+/+小鼠原代上皮細(xì)胞中的量,而EGF、TGF-α二者的蛋白表達(dá)沒有差別；
　　 (4)免疫沉淀法分別剔除野生型和基因敲出型條件培養(yǎng)基中的EGF、TGF-α后刺激Gpr48-/-上皮細(xì)胞10min,野生

6、型上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以激活Gpr48-/-上皮細(xì)胞中EGFR及其下游信號分子的活化；而剔除了Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的HB-EGF后,則不能激活Gpr48-/-上皮細(xì)胞中的EGFR及其下游信號分子的活化；
　　 (5)加入外源性HB-EGF刺激Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)Gpr48-/-中P-EGFR、P-ERK、P-STAT3水平明顯升高；而用CRM197處理Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞后,P-EG

7、FR、P-ERK、P-STAT3水平明顯下調(diào)；
　　 (6)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞前,Gpr48-/-細(xì)胞的增殖和遷移能力低于Gpr48+/+原代上皮細(xì)胞；用HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮細(xì)胞后,其增殖能力明顯增加,但遷移能力未得到明顯提高。
　　 結(jié)論:在眼瞼的發(fā)育中,GPR48通過HB-EGF反式激活EGFR信號通路,從而活化下游的ERK、STAT3等信號分子,進(jìn)