釀酒酵母泛素化酶與去泛素化酶基因敲除及泛素結合結構域表達純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、真核細胞中蛋白質特異性降解主要由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)完成。在這一途徑中,泛素首先被泛素活化酶(E1)激活,然后被轉移到泛素結合酶(E2)上;泛素連接酶(E3)識別底物和E2,并將泛素從E2上轉移到目的蛋白上;目的蛋白被泛素共價修飾,進而被26S蛋白酶體識別并降解;底物上的泛素鏈則被去泛素化酶(DUB)解離并循環(huán)使用。已有研究報道E2,E3,DUB的功能和作用機制,但很少有系

2、統(tǒng)性研究它們的調控網(wǎng)絡的報道。
　　本文利用PCR技術擴增卡那霉素抗性基因,并轉化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,通過同源重組,分別敲除E2,E3和DUB基因。之后用G418抗性平板篩選和PCR驗證,獲得E2,E3,DUB基因單敲除菌種。泛素結合結構域是廣泛存在于E2,E3,DUB中的結構域,用于識別并結合泛素。本文人工合成了泛素結合結構域基因Q2,通過分子克隆技術插入pGEX(kt)載體,構建原

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