人泛素活化酶UBE1DC1、UBE1及人泛素結合酶UBE2F的功能研究.pdf

1、泛素UB或類泛素分子UBLs作為一種蛋白修飾分子在泛素結合途徑的第一步起作用。此途徑參與體內許多重要的生理功能,包括細胞周期的調控、抗原遞呈、轉錄調控、凋亡、DNA損傷和修復等。泛素與蛋自底物的結合則是泛素化途徑必需的過程,它經由三步級聯(lián)反應機制進行下去,泛素活化酶作為在泛素化途徑第一步起重要作用的蛋白,它能活化泛素或者類泛素分子。泛素活化酶E1在需要ATP的反應中激活泛素UB或者類泛素分子產生一個高能硫羥酸酯媒介,E1-S～泛素。泛索

2、結合酶E2結合活化的泛素或者類泛素分子,并將激活的泛素部分轉移到泛素連接酶E3或底物。本文對泛素活化酶UBElDC1、UBE1及泛素結合酶UBE2F的功能進行了初步探討。
　　 人泛素活化酶UBE1DC1A(ubiquitin-activating enzyme E1-domaincontaining 1)及其新的剪接體UBE1DC1B被認為是類泛素活化酶家族成員。UBE1DC1與人泛素活化酶UBEI的相應區(qū)域具有高度同源性,且

3、兩者都具有保守的ThiF結構域,含有ATP結合結構域(GXGXXG)。通過大腸桿菌表達獲得了UBE1DC1A、UBE1DC1B、UB以及多種類泛素分子UBLs蛋白,經體外免疫印記檢測UBE1DC1活化泛素及類泛素分子的特異性發(fā)現(xiàn),它除了能活化類泛素分子Ufm1外還能活化類泛素分子SUM02,這得到了體內實驗結果的驗證。通過Blast程序同源性比較發(fā)現(xiàn)Ufm1和SUM02蛋白無同源性,說明UBE1DC1可能不像其他類泛素活化酶只能激活一種

4、類泛素分子,它能同時活化兩種不同類型的類泛素分子。同源比較和突變試驗確定了Cys250是其活性位點。UBE1DC1和SUM02在AD293細胞內的定位試驗結果表明,當UBE1DC1與SUM02共轉染細胞后,UBE1DC1的細胞定位從細胞質定位變成了細胞核定位,推測UBE1DC1可能在細胞質中激活SUM02之后轉移到細胞核中,進而參與E2反應。
　　 UBE1是首個被發(fā)現(xiàn)的泛素活化酶,它在泛素化途徑的第一步活化泛素上起重要作用。制

5、備獲得高純度的UBE1是研究其蛋白質結構與生化性質以及用于泛素化途徑下游相關酶活性測定的基礎。在全基因合成的基礎上,全長UBE1基因成功地在大腸桿菌中獲得了高表達,根據(jù)表達載體所攜帶的6His標簽以及UBE1能活化UB形成UB-UBE1復合物的特性,經Ni-NTA柱層析和Strep-Tactin Sepharose柱層析,純化得到了高純度的UBE1蛋白,純化得到的UBE1蛋白經活性分析發(fā)現(xiàn)具有泛素活化酶活性。通過對UBE1、UB以及UB

6、-UBE1復合物的二級結構測定發(fā)現(xiàn),UBE1與UB反應形成UB-UBE1交聯(lián)復合物后,它的二級構象與單一的UBE1二級構象相比發(fā)生了顯著變化,說明了UB與UBE1交聯(lián)后引起了UBE1結構較大的變化,特別是α螺旋的含量明顯增加。
　　 泛素結合酶則在泛素修飾途徑的第二步反應過程中起重要作用。通過篩選cDNA文庫,我們從人胎腦文庫中克隆到了一種新的人泛素結合酶ubiquitin-conjugating enzyme E2F,將它命名

7、為UBE2F。UBE2F基因cDNA序列全長1366bp,編碼一個185aa蛋白。它與大部分的人泛素結合酶一樣,具有同源性較高的保守結構域UBCc,且都含有半胱氨酸活性位點、UB硫脂鍵互作位點及E3互作位點。UBE2F與生物體中同源蛋白是高度保守的,且UBE2F基因在絕大多數(shù)人體組織中都有表達,因而我們推測UBE2F應該是具有泛素活化酶活性。
　　 在此研究中,我們發(fā)現(xiàn)UBE2F能結合被UBE1泛素化的UB,產生UB-UBE2F