斑馬魚D3b基因結(jié)構(gòu)及其在胚胎發(fā)育中的作用研究.pdf

1、甲狀腺激素在調(diào)控細(xì)胞的生長代謝中發(fā)揮重要作用。在成年人中，甲狀腺激素調(diào)節(jié)一生的能量代謝水平。在胚胎、新生兒、兒童期，甲狀腺激素介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化。甲狀腺激素是通過T3與甲狀腺激素受體的結(jié)合起作用的，但正常情況下，甲狀腺分泌的主要是T4。T4在外環(huán)脫碘，而轉(zhuǎn)化為T3，這將使其生物活性明顯增強(qiáng);而T4和T3若在內(nèi)環(huán)脫碘，將使它們分別生成為反T3(rT3)和T2，從而喪失其生物學(xué)活性。參與這一過程的主要是甲狀腺激素脫碘酶。在人和哺乳動(dòng)物中主要

2、存在3種不同類型的甲狀腺激素脫碘酶，分別有3種不同的基因編碼(Deiodinase，簡稱dio)。其中有dio1和dio2編碼的甲狀腺激素脫碘酶1和2（簡稱D1，D2）是主要催化甲狀腺激素的外環(huán)脫碘，可使T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3，從而增加甲狀腺激素的生物學(xué)活性。但有dio3編碼的甲狀腺激素脫碘酶3(簡稱D3)，主要發(fā)揮甲狀腺激素的內(nèi)環(huán)脫碘酶的功能，可以將T4和T3分別轉(zhuǎn)化為rT3和T2，從而是甲狀腺激素的活性喪失，它也是體內(nèi)唯一的催化甲狀腺激素失

3、活的酶。
　　斑馬魚中由于基因復(fù)制存在兩個(gè)dio3基因，一個(gè)是dio3a，一個(gè)是dio3b。我們研究的主要目的是鑒定是否兩個(gè)dio3基因都有功能以及它們在胚胎發(fā)育中的作用是否相同。研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與人dio3都是同源基因。體外研究證實(shí)同源基因dio3a，dio3b都可以編碼有活性的蛋白，都可以使T4和T3失活。雖然斑馬魚D3a和D3b酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)非常相似，但它們的基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式非常不同。我們第一次鑒定了dio3b的基因結(jié)構(gòu)

4、不同于以往發(fā)現(xiàn)的任何dio3基因，含有一個(gè)巨大的內(nèi)含子將其開放閱讀框和硒氨酸插入序列(SECIS)分開。SECIS通常位于3'UTR上，是酶的催化活性和硒蛋白的合成所必須的，介導(dǎo)硒氨酸識(shí)別UGA密碼子。最大敏感性檢測發(fā)現(xiàn)斑馬魚D3a可以外環(huán)脫碘rT3，這與其他D3蛋白都不同。這些數(shù)據(jù)提示D3a和D3b在發(fā)育中的作用可能不同。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的D1不能催化T4到T3的轉(zhuǎn)變，也不具有T3的內(nèi)環(huán)脫碘作用.這說明在斑馬魚體內(nèi)D

5、2是主要的催化甲狀腺激素激活的酶，D3是T4和T3主要的失活酶。
　　D3在人的胎盤和胎兒期表達(dá)最高，我們猜測其在胚胎發(fā)育中具有重要作用。利用morpholino介導(dǎo)的基因敲除我們發(fā)現(xiàn)dio3b敲除后斑馬魚胚胎發(fā)育明顯遲緩，72小時(shí)身體明顯變短。dio3a敲除后胚胎沒有明顯異常。dio3b敲除導(dǎo)致的身體變短的表型可以被甲狀腺激素拮抗劑部分逆轉(zhuǎn)，說明dio3b敲除身體變短的這一表型是通過甲狀腺激素的信號(hào)途徑介導(dǎo)的特異表型，并且是由局

6、部組織的甲狀腺激素信號(hào)通路的升高引起的。給予外源性T3刺激時(shí)斑馬魚胚胎長度沒有明顯異常，但其體內(nèi)dio3b和dio3a的表達(dá)量和酶活都顯著升高。
　　甲狀腺激素誘導(dǎo)的凋亡在兩棲動(dòng)物變態(tài)發(fā)育過程中非常重要。我們發(fā)現(xiàn)dio3b敲除后甲狀腺激素誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵基因Bax和Bcl-XL有明顯上調(diào)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)tp53基因表達(dá)顯著升高。我們推測dio3b敲除身體變短這一表型與P53凋亡通路有關(guān)。P53 morpholino與dio3b morp

7、holino聯(lián)合注射可以逆轉(zhuǎn)dio3b敲除引起的凋亡和身體變短的表型。這說明局部組織甲狀腺激素信號(hào)通路的升高引起的身體變短是通過上調(diào)凋亡途徑引起的。
　　哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育無法避免母體甲狀腺激素水平的影響。因此在哺乳動(dòng)物模型中研究脫碘酶D3在胚胎發(fā)育過程中的作用變得非常復(fù)雜。斑馬魚體外受精，我們dio3b敲除的斑馬魚模型為D3b可以獨(dú)立于母體甲狀腺激素水平調(diào)控胚胎大小提供了直接證據(jù)，單一基因dio3b的缺乏就可以導(dǎo)致斑馬魚胚胎身體