lncRNA對SPA作用下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　采用不同濃度的SPA處理hBMSCs，通過檢測炎癥因子的表達(dá)以及成骨活性變化情況，構(gòu)建模擬骨髓炎細(xì)胞模型;然后，通過基因芯片分析SPA處理hBMSCs成骨分化的過程中l(wèi)ncRNA差異的變化，根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，確定lncRNA的靶基因;進(jìn)一步分析lncRNA通過調(diào)控其靶基因在SPA處理的hBMSCs成骨誘導(dǎo)中的作用，明確lncRNA在骨髓炎狀態(tài)下調(diào)控hBMSCs成骨分化的機(jī)制。本研究是首次從lncRNA水平去闡述

2、骨髓炎情況下hBMSCs成骨能力不足的原因，為骨髓炎并缺損的研究提供新的理論基礎(chǔ)及研究方向，為下一步的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.SPA作用下體外骨髓炎模型的構(gòu)建
　　為了模擬骨髓炎細(xì)胞模型，不同濃度的SPA處理hBMSCs細(xì)胞。處理72h后，24孔培養(yǎng)板細(xì)胞上清被收集進(jìn)行ELISA檢測IL-1a、IL-6和TNF-a。添加不同濃度的SPA的成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，然后收集細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)沉積

3、和堿性磷酸酶檢測;
　　2.分析及驗(yàn)證SPA處理下hBMSCs成骨分化過程中l(wèi)ncRNA的變化
　　hBMSCs在含有或者不含有1μg/ml SPA的成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，收集細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA基因芯片分析。然后分析即表達(dá)差異顯著又和成骨分化密切相關(guān)的lncRNA，將以上差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，篩選出目的基因。
　　3.差異lncRNA對SPA骨髓炎模型下BMMSC成骨分化功能的影響
　　合成3條

4、NONHSAT009968干擾序列。培養(yǎng)hBMSCs細(xì)胞，根據(jù)操作說明書，使用Lipo fectamine2000試劑將大約200nm siRNA轉(zhuǎn)染到hBMSCs。干擾效率采用qRT-PCR檢測。采用siRNA-2序列進(jìn)行慢病毒包裝。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)、濃度和滴定測定、感染條件確認(rèn)以及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選。慢病毒表達(dá)NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒，感染后3天，收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞檢測NONHSAT009968確認(rèn)

5、是否成功沉默。慢病毒表達(dá)NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒感染的hBMSCs細(xì)胞培養(yǎng)14天和21天。采用茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)沉積。收集細(xì)胞進(jìn)行western blot檢測Runx2、OCN、OPN和COL1A1的表達(dá)，ELISA檢測IL-1a、IL-6、TNF-a和堿性磷酸酶檢測。分析干擾NONHSAT009968對SPA處理下的hBMSCs的成骨分化能力的影響。
　　4.差異lncRNA對SPA骨髓炎模型下BMM

6、SC成骨分化功能影響的作用機(jī)制
　　慢病毒表達(dá)NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒感染的hBMSCs細(xì)胞培養(yǎng)14天和21天。收集細(xì)胞采用qRT-PCR和western blot檢測Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)，分析干擾NONHSAT009968對Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SPA骨髓炎模型構(gòu)建成功
　　SPA可以顯著增加hBM

7、SCs細(xì)胞成骨分化過程中炎癥因子IL-1a、IL-6和TNF-a的分泌(P＜0.05)，而且炎癥因子的分泌對SPA呈濃度依賴性。另外，茜素紅染色顯示不同濃度的SPA能夠明顯抑制鈣結(jié)節(jié)沉積，而且抑制程度和SPA的濃度有密切聯(lián)系。然后ALP檢測結(jié)果表明SPA處理能夠抑制ALP的活性(P＜0.05)，并且抑制能力呈濃度依賴性。以上結(jié)果表明在1μg/ml SPA能夠明顯增加炎癥因子IL-1a、IL-6和TNF-a的分泌，抑制鈣結(jié)節(jié)沉積和ALP的

8、表達(dá)。說明SPA可以促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)及抑制hBMSCs成骨能力的下降，這一結(jié)果與體內(nèi)骨髓炎狀態(tài)表現(xiàn)一致。因此，在體外采用1μg/ml SPA處理hBMSCs能夠模擬體內(nèi)骨髓炎狀態(tài)，體外可構(gòu)建SPA骨髓炎模型。
　　2.lncRNA基因芯片結(jié)果分析
　　(1) SPA處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和對照組相比，存在2033個(gè)異常表達(dá)的lncRNAs。其中641個(gè)lncRNAs下調(diào)，1392個(gè)lncRNAs上調(diào)（倍數(shù)變化＞2.0，P＜

9、0.05）。從mRNA表達(dá)分析數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)SPA處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和對照組相比，存在449個(gè)異常表達(dá)的mRNA，其中318個(gè)mRNA顯著下調(diào)，131個(gè)mRNA顯著上調(diào)（倍數(shù)變化＞2.0，P＜0.05）。
　　(2)基于KEGG途徑分析，表達(dá)上調(diào)的mRNA包含20個(gè)不同的信號通路，最豐富的通路是唾液分泌，谷氨酸能突觸，嗅覺傳導(dǎo)和胰島素分泌?；贙EGG途徑分析，表達(dá)下調(diào)的mRNA包含20個(gè)不同的信號通路，最豐富的通路是造血，視黃醇

10、的新陳代謝，藥物代謝，細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞色素代謝外源性物質(zhì)。為了理解差異表達(dá)基因的功能，所有的差異表達(dá)基因映射到GO數(shù)據(jù)庫中并比較其背景?；趯ι镞^程進(jìn)行GO分析，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要富集在纖溶酶原激活和水轉(zhuǎn)運(yùn)，而下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要富集在對糖皮質(zhì)激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞糖脂化?；趯Ψ肿庸δ苓M(jìn)行GO分析，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)和鈣調(diào)素結(jié)合，而下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要富集在對配體-依賴的核受體轉(zhuǎn)錄共激活和葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性。

11、r>　　(3)通過cis-100k分析，五個(gè)潛在的和成骨分化相關(guān)且表達(dá)差異顯著的lncRNA被鑒定出來，包括NONHSAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、NONHSAT054627和NONHSAT009968。lncRNA的潛在靶向調(diào)控目標(biāo)分別包括骨形態(tài)形成蛋白1、SMAD1、SMAD1、膠原蛋白I型α1和Wnt3a，這些蛋白和成骨細(xì)胞分化密切相關(guān)。然后將差異的lncRNA采用qRT-PCR驗(yàn)證

12、，qRT-PCR結(jié)果表明SPA處理中和對照組中NONH SAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、NONHSAT054627和NONHSAT009968的表達(dá)顯著上升（P＜0.05），和基因芯片的結(jié)果一致。其中NONHSAT009968的表達(dá)結(jié)果提高的最為明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用NONHSAT009968以及其靶基因Wnt3a進(jìn)行研究。
　　3.沉默NONHSAT009968能夠逆轉(zhuǎn)SPA對hBMS

13、Cs細(xì)胞成骨分化的影響
　　在siRNA的檢測中siRNA-2和siRNA-3轉(zhuǎn)染后能夠顯著降低NONHSAT009968的表達(dá)(P＜0.05)，其中siRNA-2轉(zhuǎn)染后NONHSAT009968的表達(dá)量最低，干擾效率最好，可以用于后續(xù)NONHSAT009968的干擾序列。當(dāng)感染NONHSAT009968-shRNA后采用qRT-PCR檢測NONHSAT009968的表達(dá)，結(jié)果表明NONHSAT009968-shRNA干擾能夠顯著

14、降低NONHSAT009968的表達(dá)(P＜0.05)。NONHSAT009968-shRNA和NC在1μg/ml SPA中培養(yǎng)14天和21天。茜素紅染色結(jié)果表明:無論在培養(yǎng)后14天還是21天，NONHSAT009968沉默組和NC組相比，都能夠增加鈣結(jié)節(jié)沉積(P＜0.05)。堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果表明無論在培養(yǎng)后14天還是21天，NONHSAT009968沉默和NC組相比，都能夠增加堿性磷酸酶活性（P＜0.05）。另外，沉默NONHSA

15、T009968能夠增加成骨分化相關(guān)的Runx2、OCN、OPN和COL1A1蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。這些結(jié)果表明沉默NONHSAT009968能逆轉(zhuǎn)SPA抑制的hBMSCs成骨分化。
　　4.沉默NONHSAT009968促進(jìn)Wnt3a以及β-catenin和GSK-3β的表達(dá)
　　SPA處理能夠顯著抑制Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)(P＜0.05)，且該抑制結(jié)果還呈時(shí)間依賴性。該結(jié)果還表明干擾NON

16、HSAT009968的表達(dá)能夠增強(qiáng)Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)（P＜0.05）。該結(jié)果表明干擾NONHSAT009968促進(jìn)成骨分化的機(jī)制可能和Wnt3a以及β-catenin和GSK-3β的表達(dá)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究1μg/ml的SPA處理能夠促進(jìn)IL-1a、IL-6和TNF-a的表達(dá)，降低堿性磷酸酶的表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)沉積，抑制Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)，抑制hBMS

17、Cs的成骨分化，成功模擬骨髓炎狀態(tài)。
　　(2)在SPA處理hBMSCs的成骨分化的過程中，通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)存在5個(gè)和成骨分化相關(guān)的lncRNA，有NONH SAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、 NONHSAT054627和 NONHSAT009968。其中 lncRNANONHSAT009968的表達(dá)上升最為明顯，而且lncRNA NONHSAT009968潛在的cis-regul

18、ated mRNA目標(biāo)為Wnt3a。
　　(3)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)通過干擾lncRNA NONHSAT009968的表達(dá)能夠顯著提高Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(dá)，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)沉積，提高ALP的表達(dá)，促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白Runx2、OCN、OPN和COL1A1的表達(dá)，改善SPA抑制的hBMSCs的成骨分化。
　　(4)本研究首次從lncRNA角度闡明骨髓炎狀態(tài)下成骨能力下降的原因及其作用機(jī)制，為骨髓炎狀態(tài)下成骨能力