尸體空腸組織生物力學和生物化學時序性變化推斷死亡時間的研究.pdf

1、背景與目的：
　　死亡時間(Postmortem Interval,PMI)即從死亡發(fā)生到尸體檢驗的時間間隔。推斷死亡時間一直是法醫(yī)病理學研究的熱點和難點問題,準確推斷PMI對于刑事殺人案的嫌犯偵查,以及民事財產糾紛、保險理賠案件等均具有重要司法證據(jù)意義。迄今,國內外學者提出了許多死后不同階段PMI推斷的研究方法,包括利用尸體現(xiàn)象和尸周動植物生長周期等,以及尸體組織生物物理學、生物化學、免疫組織化學、分子生物學等技術方法,但這些方

2、法大多存在技術手段復雜及檢測指標單一、操作程序繁瑣,特別是影響因素多等缺陷,因此PMI推斷仍沒有得到很好的解決。
　　基于豬的組織結構與人類的相似性,本實驗以豬空腸為研究對象,應用生物力學、生物化學和量化病理學理論和技術,研究空腸組織生物力學時序性規(guī)律、組織降解規(guī)律與PMI的相關性,結合組織形態(tài)結構的量化病理學各指標之間的構效關系,探討推斷PMI的新技術手段。
　　材料與方法：
　　1、取材方法汕頭屠宰場成年4月齡健康

3、家豬,平均體重約145.5kg,屠宰后提取、分離12根空腸,置于恒溫25℃/恒濕100％、白晝光照12h人工氣候箱。
　　2、形態(tài)學觀察按分組時間點,觀察固定前空腸組織大體形態(tài)變化,在固定光源照度箱內,數(shù)碼相機1400萬像素拍照,采用Adobe Photoshop CS5軟件讀取RGB色值,分析RGB色值與PMI相關性。同時,留取部分組織,備制切片做常規(guī)HE染色和彈力、膠原纖維雙重組合染色,采用Image-Pro Plus 6.0

4、圖像分析系統(tǒng),設定RGB值255條件,在顯微鏡400倍視野下,量化分析空腸粘膜下層面積、細胞計數(shù)、空隙面積、光密度、平均直徑等指標。
　　3、“六定”原則規(guī)范化取材：
　?、俣〞r。死后2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110h、122h、134h共12個時間組,平均9根/組;
　?、诙ㄎ欢ㄏ?。剪開系膜緣,展平腸壁,沿空腸長軸/平行粘膜皺襞縱行切取略大于長寬40mm×10mm矩形空腸組

5、織試件,立即常規(guī)福爾馬林固定;
　　③定液。按9:1蒸餾水/分析純甲醛原液配制10%福爾馬林固定液;
　?、芏ū?。小腸質量與固定液溶劑比1:10,展平固定小腸,固定72小時;
　　⑤定形。取出固定組織,用電子游標卡尺測量,精確切取長寬40mm×10mm矩形試件(約<2個粘膜皺襞/試件),測量每個試件厚度,每個腸壁檢材切取3個試件,生理鹽水紗布保濕。同時,留取固定液兼作組織死后自溶腐敗的產物萃取液,待行生物化學檢測。

6、r>　　4、生物力學實驗應用WDT-Ⅲ電子萬能材料試驗機,設標距25mm、20mm/min勻速縱向拉伸,上機前預調5-10次至生物力學性能穩(wěn)定,同步采集極限載荷、極限載荷變形、平均力、應力、應變、厚度等指標,以及拉伸過程力-變形曲線。
　　5、生物化學檢測快速定性濾紙過濾各時間組福爾馬林固定-萃取液:
　?、儆^察并照相液體顏色變化;
　?、贏Z8601pH計測定固定-萃取液的酸堿度;
　?、蹜勉t鈷比色法檢測固定

7、-萃取液的色度;
　?、軕密崛旧?TU-1901紫外-可見光分光光度儀掃描測定570nm處吸光度值,分析蛋白質及其降解混合物含量變化。
　　6、統(tǒng)計分析SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行樣本t檢驗、單因素方差分析、多元逐步回歸分析,建立回歸方程。
　　結果：
　　1、大體形態(tài)變化
　　隨著PMI延長,家豬空腸組織自溶腐敗失去光澤,由淡紅色逐漸變灰黃色和灰綠色,腸壁變薄、癱軟、皺襞扁平,組織結構紋理模糊、消

8、失,臭味明顯。2-14h空腸組織光澤、彈性好、抗拉力強,質實、無臭味;26-38h,組織混濁、軟化、略透明、聞及臭味;50-74h組織菲薄、軟化、表面污穢、透亮,臭味大;98-146h腸壁菲薄、癱軟易破、明顯污穢、干枯,皺襞塌陷,氣泡產生、臭味減小。
　　2、組織形態(tài)的顯微圖像量化分析
　　⑴組織圖像RGB取色后,各時間組色值以R、B色值最佳,R、B色值分別于14-62h和14-38h下降明顯,間隔24h組間比較p<0.05

9、,與PMI的方程分別為YR=-15.99XPMI+180.41,R2=0.9297,YB=-25.23XPMI+126.44,R2=0.9321,應為色值推斷PMI窗口期。14h前以及R色值62h后、B色值38h后變化趨勢均不明顯,呈“S”型的前后平臺期。G色值變化無統(tǒng)計學意義。
　?、瞥Ｒ?guī)HE染色切片和彈力、膠原纖維雙重組合染色的組織量化病理學觀察,空腸組織面積、空隙面積等指標中,在12-108h時間段,粘膜下層膠原纖維平均直徑

10、隨PMI延長,呈上升趨勢,間隔24h組間比較差異性顯著p<0.05,擬合方程YMD=1.0099XPMI-0.2321,R2=0.935。其他指標變化均無明顯規(guī)律。
　　3、空腸組織生物力學性狀
　　各時間組極限載荷(X1)、應力、平均力、厚度(X4)均總體上隨PMI(YPMI)延長呈下降趨勢,其中極限載荷、平均力等14-62h時間段,間隔24h比較差異顯著p<0.05;應變總體組間比較P>0.05。
　　極限載荷/應

11、力/平均力與厚度為自變量,與PMI因變量的相關性R分別為-0.852、-0.763、-0.828,R2分別為0.725、0.582、0.686。其中在14-62h窗口期內,極限載荷與厚度為自變量,PMI為應變量的回歸方程為YPMI=143.50-6.26X1-18.16X4。
　　4、組織固定-萃取液檢測
　　⑴固定-萃取液pH值介于4.19-5.11之間,呈酸性,2-74h呈下降明顯,24h組間比較差異顯著p<0.05,與

12、PMI呈線性相關,YpH=-0.1313XPMI+5.1702,R2=0.9572,為推斷PMI窗口期。74-122h變化趨勢不明顯,呈單向后平臺期曲線。
　?、扑篮?-122h內,空腸組織固定-萃取液色度值隨PMI延長逐漸增高,24h組間比較差異顯著p<0.05,呈正相關性,擬合方程為:Y色度=2.2529XPMI+8.5293,R2=0.96。
　?、墙M織固定-萃取液茚三酮染色法,2-74h內上升明顯為窗口期,24h組間

13、比較差異顯著p<0.05,呈正相關性,擬合方程為YAbs=0.1416XPMI+0.1998,R2=0.9288。74-122h趨于平穩(wěn),p>0.05,呈單向后平臺期曲線。
　　結論：
　　1、尸體空腸組織的自溶腐敗時序性變化,乃是其降解代謝組學的尸體生物化學基礎,其構成尸體組織形態(tài)學變化的物質基礎,進而構成尸體組織生物力學變化的物質基礎,符合構效關系的物質基本原理,可作為利用先進的物理化學技術檢測相應與PMI相關的物質量變

14、和質變的理論依據(jù)。
　　2、家豬空腸組織生物力學性狀、固定-萃取液生物化學,以及組織形態(tài)的量化分析,呈不同的推斷PMI窗口期。其中,生物化學的窗口期為死后2-122h,生物力學性狀變化的窗口期為死后14-62h,組織形態(tài)像量化分析變化的窗口期為死后14-110h。
　　3、空腸組織固定-萃取液茚三酮染色檢測適于PMI推斷;空腸組織生物力學指標與PMI呈負相關,其中極限載荷為推斷PMI的最佳指標;組織形態(tài)的圖像量化分析法比組織