PIASy抑制ISGs轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制.pdf

1、背景：干擾素是機(jī)體細(xì)胞應(yīng)對(duì)病毒及其他生物刺激分泌的一類小分子糖蛋白。其中，I型干擾素可通過(guò)激活胞內(nèi) JAK-STAT通路啟動(dòng)眾多ISGs的轉(zhuǎn)錄，如MX蛋白、IFIT蛋白等。但當(dāng)ISGs過(guò)度激活時(shí)，可能導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫過(guò)度，甚至?xí)?dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。PIAS蛋白是一類能抑制活化的STATs轉(zhuǎn)錄活性的蛋白，從而參與ISGs的負(fù)調(diào)控過(guò)程。此外有研究發(fā)現(xiàn)，PIASy還可通過(guò)結(jié)合HDAC1及HDAC2降低目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙酰化修飾

2、，從而抑制Smad和AR基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　目的：尋找在ISGs的負(fù)調(diào)控作用中，PIASy可能互相作用的組蛋白修飾酶，并從表觀遺傳學(xué)角度研究PIASy抑制ISGs轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制。
　　方法：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）和質(zhì)譜技術(shù)，尋找與PIASy相互作用的組蛋白修飾酶，并使用熒光定量PCR（RT-PCR）及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Ch-IP）研究PIASy對(duì)ISGs基因轉(zhuǎn)錄及啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響；通過(guò)分子

3、克隆方法構(gòu)建包含不同結(jié)構(gòu)域的PIASy和RBP2重組質(zhì)粒，并應(yīng)用Co-IP技術(shù)尋找兩者相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)不同結(jié)構(gòu)域PIASy的細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR和Ch-IP研究不同結(jié)構(gòu)域?qū)SGs基因轉(zhuǎn)錄及啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響。
　　結(jié)果：PIASy可與RBP2相互作用，且在PIASy+/+的MEF細(xì)胞中，其MX1、IFIT1啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白 H3K4me3水平顯著低于 PIASy-/-細(xì)胞，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄水平

4、較低；PIASy主要通過(guò)其N端的1-218AA的區(qū)域與RBP2的JmjC結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合；與此一致的是，在穩(wěn)定表達(dá)包含有PIASy蛋白1-218AA區(qū)域的PIASy-/-細(xì)胞中，其MX1啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白 H3K4me3水平較 PIASy-/-細(xì)胞明顯下調(diào)，從而可抑制其轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論：結(jié)果表明PIASy可通過(guò)其N端1-218AA的區(qū)域招募RBP2蛋白，下調(diào)ISGs（MX1、IFIT1）啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K4me3水平，從而