溶組織內阿米巴14-3-3蛋白功能初探.pdf

1、目的：預測溶組織內阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)蛋白的結構與功能，克隆與鑒定溶組織內阿米巴14-3-3基因，并純化重組Eh14-3-3蛋白，分析純化產物的免疫學特性，制備抗重組Eh14-3-3蛋白血清，比較不同內阿米巴屬蟲株14-3-3蛋白序列，探討14-3-3蛋白作為研究遺傳進化標記分子的可能性。
　　 方法：利用生物信息學網站的各種在線工具和Vector NTI Suite軟件包對溶組織內阿米巴14-3-3(Eh14

2、-3-3)基因進行分析和功能預測，分別以溶組織內阿米巴HM1：IMSS株滋養(yǎng)體總RNA逆轉錄合成的cDNA鏈和基因組DNA為模板，設計合成引物，PCR擴增Eh14-3-3蛋白編碼基因序列，克隆入pET19b載體，并用雙酶切法和DNA測序進行鑒定。在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，用樹脂層析純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定，并用ELISA鑒定純化產物的免疫學特性，檢測病人和正常人血清對其的反應性，繼而以之免疫小鼠制備抗血清。隨后分

3、別擴增各不同內阿米巴蟲株滋養(yǎng)體的14-3-3蛋白編碼基因序列，并對它們進行了比較分析。
　　 結果：溶組織內阿米巴具有三種Eh14-3-3蛋白編碼基因的異構體，與GenBank收錄(編號分別為EHU13418，EHU13419，EHU13420)的Eh14-3-3蛋白編碼基因一致。重組Eh14-3-3蛋白，通過純化層析，30kD附近得到單一蛋白條帶。ELISA等實驗證實純化得到的Eh14-3-3蛋白與慢性反復發(fā)作者血清和阿米巴結

4、腸炎病人血清有反應，與包囊攜帶者血清、急性阿米巴肝膿瘍患者血清和正常人血清無明顯反應?？怪亟MEh14-3-3蛋白血清的與溶組織內阿米巴粗抗原ELISA反應的效價為1:200，但隨后的細胞定位實驗為陰性。不同內阿米巴屬蟲株的14-3-3蛋白序列比較結果提示內阿米巴屬14-3-3基因高度保守，生物信息學分析還提示該蛋白是研究物種進化的理想分子。
　　 結論：溶組織內阿米巴含有三個14-3-3蛋白的異構體，它們可能在溶組織內阿米巴的成