腸道病毒71型滅活疫苗(人二倍體細胞)免疫后攻毒及未免疫攻毒恒河猴嬰猴丘腦組織的比較蛋白質組學研究.pdf

1、手足口病是由腸道病毒引起的一種急性傳染病。近年來,國內報告的手足口病發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)均大幅度上升。在導致手足口病的20多種病毒中,由腸道病毒71型作為主要病原引起的手足口病發(fā)病病例數(shù)在總病例數(shù)中的比例在不斷上升。腸道病毒71型感染人體除了引起手足口病外,還可導致腦膜炎、腦炎、局部麻痹和急性遲緩性麻痹等神經系統(tǒng)疾病以及皰疹性咽峽炎等非神經系統(tǒng)疾病,嚴重者能導致患者中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥或肺水腫等致死性的臨床后果。目前關于腸道病毒71型病毒的

2、研究主要集中在病原學、流行病學方面,其對人體的致病機理尚不是十分清楚。隨著腸道病毒71型引起的手足口病發(fā)病態(tài)勢不斷擴大,而臨床上尚無公認的特效治療藥物,因此研制一種安全有效的疫苗成為防治腸道病毒71型所致手足口病的最有效的預治措施。
　　 本研究采用初步研制成功的腸道病毒71型滅活疫苗,利用恒河猴嬰猴這一經典動物模型進行了該疫苗的保護性實驗。用疫苗免疫動物后攻毒,疫苗免疫組恒河猴嬰猴神經系統(tǒng)的各個部分均未檢出超過可信限的病毒HN

3、A陽性結果,而感染對照組動物各部位均檢測到明顯的病毒HNA陽性結果。滅活疫苗能夠誘導免疫后的恒河猴嬰猴產生中和抗體,免疫后病毒攻擊后第7天恒河猴嬰猴血清中和抗體水平達1:512,能夠形成有效的抗病毒免疫保護效應。免疫組化結果顯示,免疫動物所誘導產生的免疫保護效應能夠抑制病毒在體內器官及組織中的增殖。結合攻毒后動物相應靶器官組織切片病理觀察,血清中和抗體檢測和免疫組化結果,分析表明:腸道病毒71型滅活疫苗免疫恒河猴嬰猴后,繼而以病毒攻擊,

4、將不會引起導致機體組織器官受損的病理學反應,疫苗具有保護性。
　　 此外,取上述研究對象中,免疫后攻毒和未免疫攻毒的恒河猴嬰猴中樞神經系統(tǒng)的丘腦組織進行了蛋白質組學研究。運用蛋白質組學相關技術:蛋白質雙向電泳分離蛋白和專業(yè)軟件Imagemaster7.0進行圖像分析,定量研究在病毒感染組及疫苗保護組中表達量有所差異的蛋白質點,通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜和蛋白信息數(shù)據(jù)庫建立差異蛋白質譜。
　　 本研究共發(fā)現(xiàn)48個

5、表達量變化的蛋白,按功能分為7類:①、細胞骨架相關蛋白8個,其中CFL2表達量變化結合功能分析提示該蛋白是研究EV71感染所致肌張力變化、心肌原纖維退化、心肌細胞凋亡潛在的靶點。結合各組PFN1、PFN2表達量變化與Profilins功能分析,提示在感染過程中PFN1、PFN2與細胞膜完整性或細胞內吞作用相關,疫苗的保護性降低了感染對細胞形態(tài)完整性的影響。②、小熱休克蛋白1個,CRYAB,結合該蛋白在感染高峰期表達上調而與其它組不同的表

6、現(xiàn)及其在生理或者神經變性疾病的壓力下能夠抑制中間纖維的聚集的能力,提示這種小熱休克蛋白與感染壓力下的細胞骨架穩(wěn)定性維持相關；③、生物大分子合成相關蛋白4個,其中,CyPA作為一種具有調控免疫相關的因子,可能通過某種未知的信號傳導途徑激活T細胞活化所需的細胞因子,而促進T細胞的增殖,從而顯示感染高峰CyPA表達量與其它組的差異。NUTF2作為一種入核轉運因子,其表達量變化提示其是感染狀態(tài)下宿主實現(xiàn)關閉或下調相關因子以抵抗病毒感染的可能途徑

7、之一。④、代謝相關蛋白13個,這些蛋白含量變化提示感染狀態(tài)下的神經細胞增殖周期的改變、神經元發(fā)育的阻滯、突觸后神經元的保護性抑制狀態(tài)改變等與EV71感染致病機理密切相關,對疫苗組這些蛋白表達量的分析進一步映證了疫苗的保護效應。⑤、能量代謝與生物氧化相關蛋白11個,提示病理狀態(tài)下和疫苗保護效應下機體能量代謝系統(tǒng)和生物氧化途徑發(fā)生了改變。⑥、泛素-蛋白酶體途徑相關蛋白2個,UCHL1和UBE2N在病毒感染組和疫苗保護組中的表達量差異及功能分

8、析也支持了滅活疫苗所誘導的免疫保護的有效性。⑦、信號傳導相關蛋白9個,PARK7表達變化提示中樞神經系統(tǒng)對感染的具有保護性,且可能通過PARK7實現(xiàn)。蛋白質組學實驗中共結合差異譜中表達量發(fā)生改變的蛋白的功能與免疫后攻毒和未免疫攻毒恒河猴嬰猴丘腦蛋白表達量變化分析,進一步驗證了滅活疫苗具有保護效應,發(fā)現(xiàn)了一些在感染中有重要意義的分子靶標,并為探討腸道病毒71型感染在疫苗免疫和非疫苗免疫機體中的宿主反應的分子生物學特征,以及從這一水平上認識