甲型肝炎病毒在人源二倍體細(xì)胞的分子進(jìn)化研究.pdf

1、本文中,我們將甲肝病毒野毒H<,2>W在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB<,17>連續(xù)傳代至30代,在傳代的中間代次應(yīng)用冷適應(yīng)法變異病毒,然后挑選六個(gè)子代病毒進(jìn)行基因序列分析.對(duì)H<,2>W及六個(gè)子代病毒的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,并通過PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法測(cè)定其全長(zhǎng)基因組序列.通過對(duì)所獲序列進(jìn)行同源性分析,總結(jié)甲肝病毒野毒在人源二倍體細(xì)胞連續(xù)傳代過程中的分子進(jìn)化信息.同時(shí)我們將所獲序列與HM175、LA等標(biāo)準(zhǔn)病毒株,以及L-A-1、MB

2、B、HAV7等細(xì)胞適應(yīng)病毒株進(jìn)行進(jìn)化樹分析,以研究甲肝病毒在人源二倍體細(xì)胞中的進(jìn)化方向等.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第五代之前絕大多數(shù)變異已完成,第5代相比于原代野毒株,共有648個(gè)核苷酸發(fā)生變異,其中40個(gè)導(dǎo)致了氨基酸改變.從第5代到第10代僅發(fā)生一個(gè)核苷酸變異,位于5'NCR區(qū);第10代到第14代,僅發(fā)生一個(gè)核苷酸變異,即4222位u/C突變導(dǎo)致Phe/Ser的氨基酸變異;第14代到第15代僅發(fā)生一個(gè)變異,位于5'NCR區(qū);從第15代到第30代,

3、再未觀察到任何變異發(fā)生.從變異的熱點(diǎn)看,許多與病毒適應(yīng)細(xì)胞相關(guān)的熱點(diǎn)變異均發(fā)生于第5代附近,如128至136位的連續(xù)9bp缺失、176至177位的1lbp插入序列,特別是3889位的C/U變異是病毒適應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)志性變異.與毒力相關(guān)的熱點(diǎn)變異則發(fā)生第10代到第14代之間.從病毒基因變異的時(shí)序來看,大多數(shù)變異完成于第5代附近,其中包括與細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵變異;第5代到第15代之間僅發(fā)生極少量的變異,其中包括位于4222點(diǎn)的U/C變異,這一變

4、異與毒力高度相關(guān),其發(fā)生時(shí)序?yàn)榈?0到第14代之間;第15代之后的連續(xù)傳代中病毒基因組表現(xiàn)為高度穩(wěn)定. 本文所獲序列與文獻(xiàn)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析表明,H<,2>W在進(jìn)化樹上趨近于GBM系列,而他的六個(gè)子代病毒在進(jìn)化樹上距離其親本較遠(yuǎn),更加接近于L-A-1、MBB等細(xì)胞適應(yīng)株.本文所獲得的分子進(jìn)化的時(shí)序、熱點(diǎn)、基因穩(wěn)定性等資料有助于解決活疫苗病毒株育種中相關(guān)技術(shù)問題,同時(shí)對(duì)于監(jiān)測(cè)活病毒疫苗株的遺傳穩(wěn)定性等方面的研究均可提供理論支持和技

5、術(shù)儲(chǔ)備.以甲肝病毒為模型,研究 RNA 病毒在人源二倍體細(xì)胞連續(xù)適應(yīng)傳代培養(yǎng)中的分子進(jìn)化,包括進(jìn)化熱點(diǎn)、時(shí)序、方向等.方活@2 將甲肝病毒野毒H<,2>W在人源二倍體細(xì)胞KMB<,17>中連續(xù)傳代培養(yǎng)至30代.每隔5代選取其細(xì)胞適應(yīng)子代病毒共六個(gè),用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法測(cè)定H<,2>W及選定的六個(gè)子代病毒的全基因序列.然后用序列分析軟件對(duì)所獲序列進(jìn)行分析,總結(jié)甲肝病毒野毒在長(zhǎng)期的細(xì)胞連續(xù)適應(yīng)培養(yǎng)中的進(jìn)化熱點(diǎn)、進(jìn)化時(shí)序.通過對(duì)所獲基因序列

6、與其他已知甲肝病毒株特別是細(xì)胞適應(yīng)株的進(jìn)化樹分析,研究甲肝病毒在人源二倍體細(xì)胞中的進(jìn)化方向.結(jié)果1.獲得了H<,2>W及其六個(gè)子代病毒的接近全長(zhǎng)的基因序列,并存入GenBank,錄入號(hào)分別為:H<,2>w:EF406357;H<,2>K<,5>:EF406358;H<,2>K<,10>:EF406359;H<,2>K<,15>:EF406360;H<,2>K<,20>:EF406361;H<,2>K2<,5>:EF4063 62; H<

7、,2>K<,30>:EF4063632.基于VP1/2A區(qū)168bp核苷酸片段的差異性比較,結(jié)果表明甲肝病毒野毒在適應(yīng)KMB<,17>細(xì)胞的過程中,其基因亞型由IA轉(zhuǎn)變?yōu)镮B.3.在H<,2>W適應(yīng)細(xì)胞的前5代,一共有648個(gè)核苷酸發(fā)生變異,其中有40個(gè)導(dǎo)致氨基酸改變.這些變異中包含以下熱點(diǎn)變異,如第128至136位的9bp缺失、第176至177位的11bp插入、第5018到.5023位的6bp缺失(導(dǎo)致二個(gè)親水氨基酸Asn、Asp缺失

8、)、第3889位的C/U突變(導(dǎo)致Ala/Val的氨基酸變異)等是甲肝病毒野毒在適應(yīng)細(xì)胞過程中普遍發(fā)生的熱點(diǎn)變異.在第10代到第15代之間,發(fā)生一個(gè)毒力相關(guān)的熱點(diǎn)變異,即4222位發(fā)生U/C點(diǎn)突變,該變異導(dǎo)致Phe/Ser的氨基酸突變.4.從原代到第5代,共發(fā)生648個(gè)核苷酸變異.從第5代到第10代,僅一個(gè)核苷酸發(fā)生變異,203位缺失1bp.從第10代到第15代,僅二個(gè)核苷酸發(fā)生變異,其一位于4222位的U/C點(diǎn)突變,導(dǎo)致Phe/Ser

9、的氨基酸突變.另一個(gè)則位于5'NCR.區(qū).第15代到第30代,無任何突變發(fā)生.絕大多數(shù)的變異完成于第5代附近,其中包括與細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)的熱點(diǎn)變異,其后長(zhǎng)達(dá)25代的連續(xù)傳代中僅累積發(fā)生三個(gè)變異,其中包含一個(gè)與毒力相關(guān)的變異,發(fā)生于第10代至第15代之間.5.進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,H<,2>W在進(jìn)化樹上比較趨向于GBM系列,而他的六個(gè)子代病毒則更加趨向于L-A-1、MBB等細(xì)胞適應(yīng)株.他們?cè)谶M(jìn)化樹上的距離較遠(yuǎn). 結(jié)論 1.首次觀

10、察到病毒在細(xì)胞中的完整進(jìn)化時(shí)序:獲得了甲肝病毒野毒在人二倍體細(xì)胞的進(jìn)化時(shí)序,細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)基因的變異大約完成于第5代,毒力相關(guān)基因的變異介于第10代至15代之間. 2.甲肝病毒野毒適應(yīng)人二倍體細(xì)胞連續(xù)傳代的特點(diǎn)表現(xiàn)為:快速變異后的穩(wěn)定遺傳.甲肝病毒基因組在人二倍體細(xì)胞連續(xù)傳代中的穩(wěn)定性極高.進(jìn)化方向上趨近于其他細(xì)胞適應(yīng)株如MBB、L-A-1. 3 分子進(jìn)化可用于甲肝病毒的毒力基因定位研究、毒力基因變異條件的研究以及甲肝病毒