APC-Cdh1在體內(nèi)外神經(jīng)元缺氧損傷中的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 缺血缺氧性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷在臨床常見，包括心搏驟停、失血性休克等引起的全腦缺血，以及栓塞、血栓形成引起的局灶性腦缺血等。神經(jīng)元對缺氧缺血十分敏感，缺血即時(shí)損傷和繼發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)、鈣超載、自由基損傷等可引起神經(jīng)元軸突損傷及凋亡，影響神經(jīng)功能，甚至造成死亡，但目前的各項(xiàng)治療手段效果有限。
　　 細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)及其調(diào)節(jié)亞基Cdh1

2、是細(xì)胞內(nèi)主要的泛素蛋白酶小體系統(tǒng)。Cdh1在有絲分裂晚期及G1期激活A(yù)PC，使之與底物蛋白質(zhì)連接并將泛素轉(zhuǎn)移給底物，可使泛素化的底物被蛋白質(zhì)酶體降解,在有絲分裂期向G1期轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)APC-Cdh1在成熟神經(jīng)元中有大量表達(dá)，發(fā)揮著調(diào)節(jié)軸突生長、突觸傳遞及神經(jīng)元存活的作用。我們的前期研究也表明，APC-Cdh1在大鼠海馬、皮層的神經(jīng)元中均有表達(dá)；APC-Cdh1在神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化為神經(jīng)元的過程中發(fā)

3、揮著重要作用；脊髓損傷后，下調(diào)Cdh1表達(dá)能夠促進(jìn)軸突生長及神經(jīng)功能恢復(fù)。但是，目前關(guān)于APC-Cdh1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷及疾病中的具體作用及機(jī)制，尚不清楚。
　　 缺血性腦損傷對神經(jīng)元的影響包括神經(jīng)元凋亡及軸突損傷，同時(shí)引起膠質(zhì)細(xì)胞激活、增殖，釋放多種炎性物質(zhì)及細(xì)胞因子。Cdh1在細(xì)胞周期中主要使細(xì)胞維持于G1期，我們推測Cdh1與缺血性神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)。本研究中，我們擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察局灶性腦缺血損傷后，C

4、dh1在缺血灶的表達(dá)分布，探討缺血性損傷前后Cdh1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的變化特點(diǎn)；體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元，觀察體外缺氧損傷對神經(jīng)元中Cdh1及其下游底物表達(dá)的影響；再通過慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNA干擾技術(shù)，探討體外下調(diào)Cdh1對神經(jīng)元存活、凋亡的影響，從而進(jìn)一步認(rèn)識Cdh1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷中的作用，為通過調(diào)控Cdh1治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法與結(jié)果/l
　　 1.APC-Cdh1在大鼠

5、局灶性腦缺血損傷中的表達(dá)分布特點(diǎn)方法：雄性成年SD大鼠36只，采用線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血（Middle cerebrAlartery occlusion，MCAO)模型，于MCAO 0d、1d、3d、7d采集標(biāo)本，其中對MCAO 0d動物施行假手術(shù)組，即僅分離右側(cè)頸動脈和迷走神經(jīng)，不結(jié)扎血管。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)（右側(cè)）和非缺血側(cè)（左側(cè)）腦組織Cdh1mRNA的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)法檢測缺血前后Cdh1在神

6、經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的分布變化情況。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)，MCAO模型組缺血損傷側(cè)腦組織中Cdh1mRNA表達(dá)均低于非損傷組織(P<0．05)。免疫熒光雙標(biāo)法檢測顯示，缺血損傷后損傷區(qū)大量神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，Cdh1在缺血性損傷及正常神經(jīng)元中均有大量表達(dá)；正常腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞僅極少數(shù)表達(dá)C

7、dh1，缺血損傷后可見缺血灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活，且多見Cdh1陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2.原代培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧性損傷對Cdh1及其下游底物表達(dá)的影響方法：取出生24h內(nèi)乳鼠，無菌條件下分離其大腦皮質(zhì)，體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元。培養(yǎng)第7日采用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN進(jìn)行免疫熒光鑒定神經(jīng)元所占百分比。使用無糖Earle’s 液替代細(xì)胞培養(yǎng)液，利用三氣培養(yǎng)箱充以氮?dú)猓筄2濃度維持在1％，CO2濃度為5％，37℃處理1h后復(fù)氧，建

8、立原代神經(jīng)元缺氧缺糖模型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測復(fù)氧后各時(shí)點(diǎn)Cdh1及其下游底物Skp2、Cyclin B1的表達(dá)。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，不同細(xì)胞間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)了大鼠原代神經(jīng)元，NeuN免疫熒光鑒定神經(jīng)元約占90％。建立了體外神經(jīng)元缺氧缺糖模型。體外缺氧損傷后3天、7天，原代神經(jīng)元Cdh1及其下游底物Cyclin B1表達(dá)上調(diào)(P

9、<0．05)，而Skp2在缺血后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均下調(diào)(P<0．05)。
　　 3.慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNAi對原代神經(jīng)元凋亡的影響方法：取出生24h內(nèi)SD乳鼠大腦皮質(zhì)，使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)神經(jīng)元。神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7天，按病毒與細(xì)胞的比例(MOI值=10、50和100)加入含GFP的慢病毒Cdh1RNAi載體。感染后72h采用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，計(jì)算感染效率，確定慢病毒感染神經(jīng)細(xì)胞的合適MOI。之后進(jìn)行慢病毒感染，實(shí)

10、時(shí)定量PCR檢測慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNAi后Cdh1的表達(dá)改變。慢病毒感染神經(jīng)元后第7天， TUNEL法檢測慢病毒感染組及對照組神經(jīng)元凋亡情況。不同細(xì)胞間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：采用慢病毒感染神經(jīng)元，MOI為100時(shí)能夠滿足后續(xù)的研究。感染后各時(shí)間點(diǎn)LV-Cdh1RNAi組較未感染組Cdh1表達(dá)降低(P<0．05)。TUNEL法檢測顯示慢病毒感染后神經(jīng)元凋亡無明顯影響 (P>0．05)。

11、
　　 研究結(jié)論
　　 1.APC-Cdh1在正常大鼠腦組織中有大量表達(dá)，且主要定位于神經(jīng)元；大鼠局灶性腦缺血性損傷后，神經(jīng)元內(nèi)仍有Cdh1表達(dá)。正常大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞少見Cdh1陽性，而缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，且部分呈Cdh1陽性。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)表明缺氧缺糖損傷后，神經(jīng)元中Cdh1表達(dá)升高，其下游底物Cyclin B1上調(diào)，而Skp2表達(dá)下調(diào)。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建的Cdh1R

12、NAi慢病毒載體可在體外下調(diào)原代培養(yǎng)神經(jīng)元Cdh1的表達(dá)，但慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNAi短期內(nèi)對神經(jīng)元凋亡無明顯影響。
　　 研究總結(jié):
　　 本課題首先通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示缺氧缺血性損傷后，Cdh1在不同神經(jīng)細(xì)胞中的差異性表達(dá)。在正常腦組織中，Cdh1主要表達(dá)在神經(jīng)元，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少。局灶性缺血性腦損傷后，缺血組織Cdh1mRNA的表達(dá)下降，缺血灶內(nèi)大量神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，推測其已發(fā)生凋亡或死亡，幸存神經(jīng)元內(nèi)仍

13、見Cdh1表達(dá)；缺血灶周邊星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，且部分呈Cdh1陽性，提示Cdh1可能參與缺血后神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞激活的過程。
　　 通過培養(yǎng)原代大鼠皮層神經(jīng)元，并構(gòu)建體外神經(jīng)元缺氧缺糖模型，觀察體外神經(jīng)元缺氧損傷對Cdh1mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)損傷后Cdh1的表達(dá)上調(diào)，其下游底物Cyclin B1表達(dá)趨勢與Cdh1相近，Skp2表達(dá)下調(diào)，推測Cyclin B1表達(dá)上調(diào)可能通過負(fù)反饋?zhàn)饔檬沟肅dh1在神元中表達(dá)升高，而Cdh