犬細(xì)小病毒的分離鑒定與生物學(xué)特性研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒病在1978年成為全球性疾病,并且從那以后在世界各地呈地方性流行(Parrish,1990；Truyen,1995)。本研究旨在獲得華中地區(qū)的犬細(xì)小病毒分離株并對(duì)其基因型分型、流行病學(xué)、生物學(xué)特性及致病力進(jìn)行探討。
　　 從武漢部分寵物醫(yī)院采集膠體金初檢陽(yáng)性的50份可疑病料,用貓腎細(xì)胞(F81)進(jìn)行病毒分離,并進(jìn)行電鏡觀察。根據(jù)犬細(xì)小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用來(lái)鑒定CPV；參考文獻(xiàn)(kapil

2、 et al.,2007)合成另一對(duì)引物,用來(lái)調(diào)查犬細(xì)小病毒的不同基因型的流行狀況；參考CPV全序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2全長(zhǎng)的引物,并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。為了得到分離株的閱讀框(ORF),又設(shè)計(jì)了四對(duì)引物。在細(xì)胞上對(duì)最先分離到的5株病毒進(jìn)行空斑純化,進(jìn)行一步法生長(zhǎng)曲線測(cè)定。最后對(duì)這5株病毒都進(jìn)行動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。
　　 細(xì)胞傳代結(jié)果表明,從50份病料中獲得了34株犬細(xì)小病毒。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明獲得390bp、583bp和1755bp三個(gè)片段

3、。與Genbank發(fā)布的CPV-2比對(duì)后,390bp的測(cè)序結(jié)果表明我們獲得的28株病毒是犬細(xì)小病毒而583bp測(cè)序的結(jié)果表明所獲得的28株病毒中,有30株屬于2a型,4株屬于2b型。對(duì)VP2全序列進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析表明,我們得到的分離株與最早分離的毒株距離最遠(yuǎn),與歐洲、美洲的毒株距離較遠(yuǎn),與中國(guó)分離株較近?？瞻呒兓吧L(zhǎng)曲線繪制結(jié)果表明分離毒株增殖滴度可達(dá)105.5PFU/mL。通過(guò)比較同步接毒和非同步接毒所繪制的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn),在接毒的

4、前12小時(shí)內(nèi)略微有點(diǎn)區(qū)別,細(xì)胞傳代8小時(shí)后進(jìn)行接毒的生長(zhǎng)曲線一開(kāi)始有下降趨勢(shì),接著又慢慢開(kāi)始上升,而同步接毒的生長(zhǎng)曲線從一開(kāi)始接毒就是上升趨勢(shì)。在一定條件下都可以凝集豬的紅細(xì)胞,并且該凝集可以被犬細(xì)小病毒單克隆抗體特異性阻斷。電鏡觀察結(jié)果表明,感染細(xì)胞的線粒體腫脹。通過(guò)PCR,我們得到了毒株3和毒株10的完整的ORFs。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明犬只都能表現(xiàn)不同程度的發(fā)病狀況,如嘔吐、排血便等。在細(xì)胞上檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有排毒現(xiàn)象,最高排毒量可達(dá)10