杜氏鹽藻鞭毛內(nèi)運輸?shù)鞍譏FT88基因的克隆及功能分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細胞真核生物,有一對約13μm的等長雙鞭毛,其具有典型的“9+2”結(jié)構(gòu),利用普通的理化手段即可調(diào)節(jié)鞭毛的再生和解聚。與模式生物萊茵衣藻相比,杜氏鹽藻無細胞壁,結(jié)構(gòu)上更接近哺乳動物細胞,且其結(jié)構(gòu)簡單,生長周期短易于培養(yǎng),鞭毛形態(tài)及結(jié)構(gòu)易于觀察,所以非常適合作為研究鞭毛/纖毛長度調(diào)控機制的模式生物。
   鞭毛和纖毛是進化上保守的普遍存在于多種細胞表面的細胞器,它們的結(jié)構(gòu)基本相同。鞭毛/纖毛內(nèi)運輸是定位在鞭

2、毛/纖毛膜和軸絲之間的一種基于微管的運輸機制。很多鞭毛/纖毛相關(guān)蛋白顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)由驅(qū)動蛋白Ⅱ所驅(qū)動的鞭毛底部到頂端的運輸(即正向運輸)和由動力蛋白所驅(qū)動的從鞭毛頂端到底端的運輸(即逆向運輸)。IFT蛋白(intraflagellartransportprotein)對于真核細胞鞭毛/纖毛的裝配和維護是必不可少的。
   IFT復(fù)合體包含20種以上IFT蛋白,可分為IFT-A和IFT-B。IFT88蛋白是IFT-B的成分之一,它是

3、由IFT88基因所編碼的,該基因?qū)儆?tetratricopeptiderepeat,TPR)多肽重復(fù)序列家族成員,此重復(fù)序列能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用[1],對IFT88蛋白的運輸功能起著極其重要的作用。在衣藻細胞內(nèi),IFT88能夠與IFT52,IFT46和Hsp40相互作用,IFT88基因的缺失會導(dǎo)致鞭毛組裝缺陷。在小鼠中,IFT88同源蛋白Tg737的突變會引起多囊腎疾病[2],且Tg737的突變與小鼠的視覺、嗅覺的功能障礙也有一

4、定關(guān)系[3-4]。
   由于IFT88在鞭毛組裝中的重要的作用,IFT蛋白在綠色藻類,線蟲類和脊椎動物中都非常保守,并且IFT88在鹽藻中的功能未見報道。本試驗根據(jù)實驗室鹽藻鞭毛再生過程中的轉(zhuǎn)錄組測序片段(共591個核苷酸,在NCBI比對與衣藻IFT88mRNA片段有71%的同源性),通過3’和5'RACE擴增得到其cDNA全長,使用機械研磨法去除鹽藻鞭毛后使鹽藻鞭毛再生,分別用碘染[5-6]和銀染[7]方法觀察杜氏鹽藻鞭毛的

5、再生情況,并用實時熒光定量PCR檢測了IFT88mRNA在鞭毛再生過程中的表達情況。隨后利用ORFfinder預(yù)測并擴增其開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF),構(gòu)建了IFT88的原核表達載體并誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達。本試驗利用鹽藻作為模式生物來研究IFT88的功能,為進一步研究IFT88在細胞內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。
   方法:
   1.杜氏鹽藻IFT88基因全長的克隆
  

6、根據(jù)本實驗室鹽藻轉(zhuǎn)錄組測序片段(共591個核苷酸,在NCBI比對與衣藻有71%的同源性),分別設(shè)計其3'內(nèi)、外測引物及5'端內(nèi)、外側(cè)引物,3'RACE法,5'端PCR法擴增IFT88的cDNA序列,測序后使用DNAMAN拼接,最后驗證所得序列。
   2.杜氏鹽藻IFT88的功能分析
   使用機械研磨法處理杜氏鹽藻,使其脫去鞭毛,正常培養(yǎng),使鞭毛發(fā)生再生,并分別用銀染和碘染方法觀察杜氏鹽藻鞭毛。同時在再生過程中提取部分

7、時間點杜氏鹽藻總RNA;分別將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)實時熒光定量PCR引物設(shè)計要求,設(shè)計一對引物,以GAPDH基因作為內(nèi)參,以反轉(zhuǎn)錄的杜氏鹽藻cDNA作為模板,進行實時熒光定量PCR,在轉(zhuǎn)錄水平上研究杜氏鹽藻IFT88基因在鞭毛再生過程中相對表達量的變化。
   3.杜氏鹽藻IFT88蛋白的原核表達
   將杜氏鹽藻IFT88基因開放閱讀框與原核表達載體pET28a(+)連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3

8、),IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測IFT88蛋白表達情況。
   結(jié)果:
   1.杜氏鹽藻IFT88基因全長的克隆
   克隆得到杜氏鹽藻IFT88基因全長為3054bp,其中包括316bp的5'UTR、428bp的3'UTR以及2400bp的開放閱讀框,共編碼799個氨基酸殘基。蛋白序列與多個物種的IFT88具有很高的同源性,其中與萊茵衣藻IFT88基因的同源性約為59%

9、。
   2.杜氏鹽藻IFT88的功能分析
   通過碘染和銀染對鹽藻染色,在顯微鏡下觀察到鹽藻鞭毛再生過程中鞭毛長度的變化。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示杜氏鹽藻IFT88mRNA的表達量在去鞭毛后30min左右時最高。與鞭毛生長速率基本一致。證明IFT88在杜氏鹽藻鞭毛的再生過程可能起著非常重要的作用。
   3.杜氏鹽藻IFT88蛋白的原核表達
   聚丙烯凝膠電泳結(jié)果顯示:與對照組相比,誘導(dǎo)組在90k

10、Da左右有特異性條帶出現(xiàn),與預(yù)測的IFT88蛋白大小相同。
   結(jié)論:
   1.克隆拼接得到杜氏鹽藻IFT88基因全長為3054bp,其中包括316bp的5'UTR、428bp的3'UTR以及2400bp的開放閱讀框,共編碼799個氨基酸殘基。
   2.IFT88在杜氏鹽藻鞭毛的再生30min時表達量增加,說明其在鞭毛再生過程中可能起著非常重要的作用。
   3.成功誘導(dǎo)了IFT88在大腸桿菌中的表

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