基因重組對(duì)歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒生物學(xué)特性的影響.pdf

1、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是分為8個(gè)節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科。H1N1亞型SIV主要包括古典、歐洲類禽、重組及人源H1N1亞型SIV。歐洲類禽H1N1亞型SIV自1979年在歐洲發(fā)現(xiàn)后，迅速于歐洲和亞洲豬群中流行開來。特別是近年來，重組的H1N1亞型SIV在豬群中被大量地鑒定并分離到，表明不同來源的H1N1亞型SIV在豬群中廣泛并復(fù)雜的分布。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于基因重組對(duì)該種亞型的SIV生物學(xué)

2、特性的影響尚不清楚。
　　本研究在前期國(guó)內(nèi)部分地區(qū)分子流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，通過對(duì)豬流感病毒的分子進(jìn)化分析，確定兩株代表性毒株，分別為歐洲類禽H1N1亞型SIV(A/swine/Tianjin/6/2011(H1N1)，簡(jiǎn)稱TJ6）和三源重組H1N1亞型SIV(A/swine/Tianjin/10/2013(H1N1)，簡(jiǎn)稱TJ10）。通過體內(nèi)及體外試驗(yàn)，對(duì)兩株病毒在MDCK細(xì)胞、豬及小鼠體內(nèi)復(fù)制和致病能力進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明:

3、TJ6在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TJ10;TJ10在豬和小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)較高的致病力，引起的病理性損傷更嚴(yán)重，在肺臟及鼻甲骨中的病毒滴度更高。
　　為探究?jī)煞NH1N1亞型SIV感染宿主后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的差異，利用RNA-seq高通量測(cè)序，對(duì)不同的病毒感染小鼠后的肺組織進(jìn)行了mRNA轉(zhuǎn)錄組差異性分析。在對(duì)兩毒株的差異表達(dá)基因檢測(cè)過程中，總共篩選到4588個(gè)差異顯著表達(dá)的基因。與對(duì)照組相比，TJ6、TJ10分別有1275和3871個(gè)差

4、異基因。與TJ6相比，TJ10有2681個(gè)差異基因，包括1125個(gè)上調(diào)，1556個(gè)下調(diào)。通過對(duì)差異基因進(jìn)行GO分類統(tǒng)計(jì)、KEGG分析及eggNOG分類發(fā)現(xiàn)，各個(gè)比對(duì)組中有大量的差異基因參與免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程以及與癌癥、甲型流感病毒、細(xì)胞因子受體互作相關(guān)的通路。與TJ6相比，TJ10感染小鼠后引起宿主非正常的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)以及抗病毒感染過程，導(dǎo)致宿主體內(nèi)細(xì)胞因子上調(diào)或下調(diào)，引發(fā)宿主免疫系統(tǒng)失調(diào)，從而引起小鼠的死亡。

5、　　為進(jìn)一步解析病毒分子致病機(jī)制，本研究對(duì)強(qiáng)弱毒株進(jìn)行序列測(cè)定及氨基酸序列差異性分析。通過測(cè)序得出，兩毒株在基因片段NS、NP、PA、PB1、PB2差異較大。分別構(gòu)建上述兩株病毒的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，成功獲得兩毒株的拯救株rTJ6、rTJ10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，拯救毒株與野生毒株在MDCK細(xì)胞上以及豬及小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力幾乎一致，具有相同的生物學(xué)特性。通過對(duì)單個(gè)基因片段或多個(gè)基因片段的替換，拯救并鑒定了多種重組病毒。體內(nèi)外研究數(shù)據(jù)表明，組

6、成核糖核蛋白復(fù)合物的NP、PA、PB1、PB2共同提高了聚合酶活性;NS1通過拮抗干擾素的生成來促進(jìn)病毒的復(fù)制。由此推斷，病毒重組后通過核糖核蛋白復(fù)合物基因與NS基因協(xié)同作用，促進(jìn)了病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，提高了病毒毒力。
　　基因重組是流感病毒演化的動(dòng)力，它使得流感病毒獲得抗原性的變異，從而可以逃避宿主的免疫應(yīng)答，甚至引發(fā)新的大流行毒株的產(chǎn)生。本研究有助于人們了解流感病毒的進(jìn)化方式，為下一次流感的大流行提供可靠的理論依據(jù)，并且進(jìn)一步提