重組高產(chǎn)H1N1亞型豬流感滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)效力評價.pdf

1、豬流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬的分節(jié)段、負(fù)鏈RNA病毒，是引起豬呼吸道疾病的一種重要病原體。世界上豬群中流行的主要亞型為H1N1、H1N2和H3N2，其中歐洲禽源H1N1亞型和古典H1N1亞型SIV是國內(nèi)主要的流行株。研究表明古典H1N1亞型SIV演化成為重組病毒并引發(fā)2009年人群中出現(xiàn)流感大流行，而在歐洲和亞洲也出現(xiàn)了關(guān)于歐洲禽源H1N1亞型SIV感染人的報道。因此防控S

2、IV在豬群中傳播具有重要意義，同樣對指導(dǎo)和防控人及禽的流感病毒起到積極的輔助作用。
　　本研究以國內(nèi)流行的歐洲禽源H1N1亞型SIV（A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)，簡稱SH1)為試驗材料，RT-PCR擴(kuò)增HA和NA基因并插入至PBD載體中，構(gòu)建HA和NA基因的重組質(zhì)粒。將HA、NA重組質(zhì)粒及來源于流感病毒高產(chǎn)株P(guān)R8的6個內(nèi)部基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，成功拯救了重組歐亞禽源H1N1亞型SIV疫苗

3、候選株（SH1/PR8）。MDCK細(xì)胞病毒生長曲線繪制結(jié)果表明，相對于原始毒株，重組病毒具有更高的病毒滴度：SH1/PR8以0.001MOI的劑量接種MDCK細(xì)胞48h后，病毒滴度最高且效價達(dá)到1×108TCID50/ml，血凝效價達(dá)到29，而原始毒株SH1的滴度為106TCID50/ml，血凝效價為27。病毒蝕斑試驗結(jié)果也顯示，重組病毒SH1/PR8形成的病毒蝕斑比原始毒株SH大，在MDCK細(xì)胞上具有更強(qiáng)的復(fù)制能力。前期本實驗室以古典

4、H1N1亞型SIV（A/swine/Guangdong/1/2011(H1N1)簡稱G11）為材料，成功構(gòu)建了重組病毒G11/PR8，本研究MDCK細(xì)胞病毒生長曲線繪制結(jié)果顯示，重組病毒G11/PR8的病毒滴度達(dá)到2×108TCID50，血凝效價達(dá)到210，相對于原始病毒G11同樣具有更強(qiáng)的復(fù)制能力。
　　將重組病毒SH1/PR8添加油乳佐劑制備成歐洲禽源H1N1亞型豬流感單價滅活疫苗，在小鼠和豬體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)效力的評價。小鼠體

5、內(nèi)抗體檢測結(jié)果顯示，免疫4周后HI抗體、中和抗體和IgG抗體效價持續(xù)升高，第4周達(dá)到最高的抗體效價。攻毒后小鼠體重變化和存活率試驗結(jié)果表明，免疫組體重未明顯下降且存活率為100％，而非免疫組小鼠體重持續(xù)下降至70%且攻毒6天后死亡率為100%。攻毒后肺臟組織病毒含量檢測和病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，免疫滅活疫苗能夠有效抑制SH1病毒在肺臟中的復(fù)制，減輕肺臟病理變化。同樣重組滅活疫苗免疫也能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較高的抗體效價，通過檢測攻毒后第5天豬鼻拭子

6、、鼻甲骨和肺泡灌洗液中病毒的含量，結(jié)果顯示免疫疫苗組都未檢測到病毒肺臟的病變觀察和組織病理檢測也顯示免疫滅活疫苗能顯著降低病毒對豬肺臟的損傷。
　　將重組病毒SH1/PR8和G11/PR8添加油乳佐劑制備成歐洲禽源和古典H1N1亞型豬流感二價滅活疫苗，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)效力評價，結(jié)果顯示，二價重組滅活疫苗能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高的針對歐洲禽源和古典H1N1亞型SIV的HI抗體、中和抗體和IgG抗體效價，能對兩種病毒的攻擊提供有效