馬鈴薯晚疫病廣譜抗性QTL dPI09c的精細(xì)定位及抗性基因克隆.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)就消費(fèi)而言是世界上第三大糧食作物，也是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，目前國(guó)家推進(jìn)的馬鈴薯主食產(chǎn)品開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略，對(duì)保障糧食安全和促進(jìn)飲食健康具有重要意義。由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病給馬鈴薯的生產(chǎn)造成了毀滅性災(zāi)害，目前過(guò)量的施用化學(xué)農(nóng)藥既增加了生產(chǎn)成本，也對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，更重要的是并沒(méi)有有效遏制病害的發(fā)生與蔓延。因此，選

2、育對(duì)晚疫病具有廣譜和持久抗性的品種，是馬鈴薯育種迫切需要解決的問(wèn)題。然而，晚疫病的持久抗性機(jī)理尚不清楚，以至于一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)國(guó)內(nèi)外晚疫病抗病育種進(jìn)展有限。
　　馬鈴薯中具有NB-LRR結(jié)構(gòu)域的主效抗性基因抗性持續(xù)時(shí)間較為短暫，目前認(rèn)為馬鈴薯對(duì)晚疫病的田間抗性更持久、更廣譜，因此選育具有田間抗性的材料成為了育種工作者的另一個(gè)選擇。本實(shí)驗(yàn)室前期與國(guó)際馬鈴薯中心(the International Potato Center)合作，構(gòu)建

3、了一個(gè)具有廣譜田間抗性的二倍體馬鈴薯群體B3C1HP100，并在9號(hào)染色體末端初步定位到一個(gè)主效QTL dPI09c。
　　本研究在前期已有的研究基礎(chǔ)之上，通過(guò)圖位克隆、dRenSeq、等位基因挖掘的方法精細(xì)定位并克隆了控制這個(gè)晚疫病廣譜抗性主效QTL位點(diǎn)的基因R8，進(jìn)而通過(guò)比較基因組的方法，揭示了該位點(diǎn)可能存在的進(jìn)化機(jī)制。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.離體葉片的抗性評(píng)價(jià)及晚疫病病原菌篩選。利用6個(gè)來(lái)源和毒力不同的晚疫病菌

4、株，隨機(jī)對(duì)原始定位群體B3C1HP100的部分單株進(jìn)行離體葉片接種，結(jié)果顯示3個(gè)中等毒力的菌株88069、HB16-1和Ljx18接種后，抗性后代表現(xiàn)為完全抗病，感病后代表現(xiàn)為感病;3個(gè)強(qiáng)毒力菌株UK3928a、HB14-2和EC-1接種后，抗性后代單株的抗病程度出現(xiàn)變化，但均為抗病等級(jí)，而感病后代仍表現(xiàn)感病。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)B3C1HP100群體對(duì)不同的病原菌具有廣譜抗性，菌株88069被選擇用于后期試驗(yàn)。
　　2.dPI09

5、c區(qū)間標(biāo)記開(kāi)發(fā)與加密。根據(jù)初定位結(jié)果，利用651對(duì)引物（包括已報(bào)道的馬鈴薯9號(hào)染色體末端的304對(duì)基因標(biāo)記引物及本研究針對(duì)初定位標(biāo)記At3g24160f2(58.72Mb)到染色體末端(61.54Mb)的基因組序列開(kāi)發(fā)的347對(duì)基因標(biāo)記引物）對(duì)抗、感親本和群體后代的抗感池進(jìn)行篩選，得到44對(duì)多態(tài)性引物，用于dPI09c區(qū)段加密。
　　3.QTL dPI09c的精細(xì)定位。通過(guò)對(duì)原始群體B3C1HP100和本研究構(gòu)建并篩選獲得的重組子

6、群體B3C1HP106/4000共206個(gè)單株的基因型鑒定，結(jié)合表型數(shù)據(jù)分析，篩選獲得了3個(gè)重組單株，將dPI09c區(qū)間縮小到了參考基因組上389kb范圍。
　　4.BAC文庫(kù)的構(gòu)建與篩選。利用B3C1HP100群體中的一個(gè)抗病后代304413.40構(gòu)建了覆蓋馬鈴薯基因組約10倍的BAC文庫(kù)。利用本研究開(kāi)發(fā)的位于dPI09c兩端的標(biāo)記3233-1，8384-1和8586-1，以及共分離標(biāo)記jr38，5455-1，jr69和jr78

7、-2，從BAC文庫(kù)中篩選到覆蓋dPI09c的7個(gè)陽(yáng)性BAC克隆，對(duì)其中兩個(gè)能夠覆蓋整個(gè)區(qū)段的克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示dPI09c的物理距離為186kb，與參考基因組389kb的距離相比，減少了200kb距離。經(jīng)序列預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段有10個(gè)注釋為番茄抗斑萎病病毒基因Sw-5b的預(yù)測(cè)基因，因此，對(duì)克隆控制dPI09c抗性的候選基因奠定了基礎(chǔ)。
　　5.dPI09c位點(diǎn)基因分析。根據(jù)BAC序列預(yù)測(cè)結(jié)果，dPI09c區(qū)間含有NB-LRR基因

8、簇。因此，本研究分別構(gòu)建了2個(gè)抗病池和2個(gè)感病池，兩個(gè)抗病池分別為抗性母本301071.3以及由群體B3C1HP100中27個(gè)抗性個(gè)體組成的混合抗病池;感病池分別為感病父本703308以及由27個(gè)感病個(gè)體組成的混合感病池。利用新開(kāi)發(fā)的R基因診斷技術(shù)dRenSeq，在抗病池中獲得了唯一的全長(zhǎng)基因R8，說(shuō)明R8可能參與了dPI09c對(duì)晚疫病的抗性。
　　6.R8等位基因挖掘及功能驗(yàn)證。利用等位基因挖掘的方法在抗性母本301071.3和

9、2個(gè)抗性后代304413.40及304413.74中驗(yàn)證了dPI09c的抗性是由晚疫病抗病基因R8所提供。同時(shí)，利用相同的方法，在B3C1群體以及國(guó)內(nèi)的抗病材料中克隆到R8，說(shuō)明R8基因在不同地域和不同馬鈴薯基因型中發(fā)揮著重要的抗病功能。另外，在馬鈴薯野生種S.demissum中發(fā)現(xiàn)了R8的同源基因R8-like，基因功能鑒定表明它與R8相同，也具有晚疫病抗性，并且能夠與無(wú)毒基因Avr8識(shí)別產(chǎn)生HR反應(yīng)。由于原始定位群體和許多現(xiàn)代品種中

10、都有來(lái)自于S.demissum的抗性背景，推測(cè)R8可能來(lái)自于野生種S.demissum。
　　7.dPI09c基因組比較分析。對(duì)5個(gè)茄科材料[DM1-3516R44(S.phureja)、MaR8(1/2S.demissum)、304413.40(B3C1HP100)、Heinz1706(S.lycopersicum)和S.pennellii]在dPI09c區(qū)間的序列進(jìn)行了比對(duì)分析，表明茄科不同物種的基因組在該區(qū)段發(fā)生了染色體重排

11、事件，但是R8及其同源蛋白的序列相對(duì)較為保守，暗示這些R8的同源蛋白可能起源于相同的祖先，但是在不同的物種中因受到不同的選擇壓而出現(xiàn)了dPI09c區(qū)域進(jìn)化上的差別。
　　8.R8特異效應(yīng)子Avr8的特異性與識(shí)別位點(diǎn)。在15個(gè)不同的晚疫病菌菌株中均克隆獲得了無(wú)毒基因Avr8，結(jié)果顯示其廣泛存在于不同的晚疫病菌株中且序列高度保守。氨基酸序列的短截實(shí)驗(yàn)證明，Avr8的C端效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域是與R8識(shí)別的重要區(qū)域。亞細(xì)胞定位顯示，Avr8可能在