編碼CK2激酶底物的c1orf109基因結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、癌癥是導(dǎo)致人類疾病死亡的主要原因之一。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特征,也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因。關(guān)于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的研究一直是生命科學(xué)的研究熱點,但長期以來其分子機(jī)制一直未得到完全闡明。
　　為了尋找參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因,本課題組對細(xì)胞來源相同但轉(zhuǎn)移能力不同的兩個人肺腺癌細(xì)胞系的基因表達(dá)差異進(jìn)行分析時,獲得了一個存在差異表達(dá)的cDNA片段。隨后,采用生物信息學(xué)方法、RACE(Rapid Ampl

2、ification of cDNA End)技術(shù)和DNA測序相結(jié)合的方法獲得了該基因的mRNA全序列。BLASTN比對結(jié)果顯示,該基因與Homo Sapiens Chromosome 1 OR F109(c1orf109,序列號為NM_017850.1)同源,是一個功能未知的新基因。為了進(jìn)一步研究c1orf109基因的表達(dá)及生物學(xué)功能,在本文中將對該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式、及其在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控過程中的作用進(jìn)行初步的

3、研究。此外,還對其潛在的相互作用分子進(jìn)行了篩選和驗證。
　　本研究采用雙熒光素酶活性分析、凝膠電泳遷移率分析(EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析等技術(shù),對c1orf109基因啟動子區(qū)的順式作用元件和反式作用因子進(jìn)行了確認(rèn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在c1orf109基因的啟動子區(qū)域內(nèi)存在兩個關(guān)鍵的順式調(diào)控元件,CAATbox和TATAbox。同時,實驗結(jié)果還表明,c1orf109基因的5′非翻譯區(qū)可以特異地結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Sp1,轉(zhuǎn)錄因子Sp

4、1參與c1orf109基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。
　　為分析c1orf109基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能,本研究首先對蛋白C1ORF109的基本理化性質(zhì)、親疏水性、高級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測,提示C1ORF109可能是蛋白激酶CK2的底物,其第104、134、182位絲氨酸殘基是其潛在的磷酸化位點。在C1ORF109蛋白定位分析中,通過免疫熒光和細(xì)胞組分分離等實驗證實,C1ORF109主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。實驗結(jié)果

5、亦證實了C1ORF109是一個磷酸化蛋白質(zhì),并可在體外被CK2激酶特異的磷酸化,CK2激酶對C1ORF109的磷酸化不影響后者在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　為明確c1orf109基因與腫瘤的關(guān)系,本研究還采用免疫印跡和實時定量PCR等方法對肝癌臨床病例組織、乳腺癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、黑色素瘤細(xì)胞系中c1orf109基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,肝癌組織c1orf109基因mRNA表達(dá)增高,蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)一致。而且C1ORF1

6、09蛋白在多種腫瘤細(xì)胞系中均呈現(xiàn)表達(dá)增高的趨勢。結(jié)合C1ORF109在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的特點和CK2激酶在細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用,我們進(jìn)一步分析了c1orf109基因在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的作用。pcDNA3.1-c1orf109重組體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌Hs578T細(xì)胞,在集落形成實驗中,過表達(dá)外源C1ORF109重組蛋白的細(xì)胞所形成的集落數(shù)明顯增多(P<0.05),PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)和cyclinD1的表達(dá)水平呈

7、上升趨勢,流式分析結(jié)果顯示,過表達(dá)外源C1ORF109重組蛋白的細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少,侵襲小室結(jié)果顯示過表達(dá)外源C1ORF109重組蛋白的細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(P<0.05)。同時,運用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),證實在特異性沉默乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞c1orf109基因的表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制,PCNA和cyclinD1的表達(dá)下調(diào),出現(xiàn)G1期阻滯,侵襲能力降低(P<0.

8、05),這些結(jié)果再次證實了c1orf109基因在細(xì)胞增殖和周期調(diào)控,以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　利用原核表達(dá)的GST-C1ORF109重組蛋白對HeLa細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行GSTpull-down分析,差異條帶經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析后得到多種與C1ORF109蛋白有潛在相互作用的蛋白因子,并采用免疫熒光共定位和免疫共沉淀的方法證實了C1ORF109與MARVELD1蛋白之間的相互作用,二者間的相互作