蛋白激酶CK2與朊蛋白及朊病毒病關(guān)系的研究.pdf

1、本文為了探討CK2在TSE中樞神經(jīng)組織中可能的變化，以保存的羊瘙癢因子263K顱內(nèi)感染倉(cāng)鼠的腦組織、羊瘙癢因子139A顱內(nèi)感染C57BL小鼠腦組織和羊瘙癢因子139A顱內(nèi)感染倉(cāng)鼠腦組織為研究對(duì)象，制備腦組織懸液，利用cK2α多克隆抗體和CK2β單克隆抗體，采用免疫印跡方法觀測(cè)腦組織中的CK2以及各個(gè)亞基的存在情況，同時(shí)，以同種屬、同齡正常動(dòng)物腦組織做為對(duì)照進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常倉(cāng)鼠和小鼠腦組織中可見(jiàn)含量穩(wěn)定的CK2α和CK2β，其它

2、類(lèi)型的CK2α(CK2α′、CK2α″)幾乎檢測(cè)不到。與正常動(dòng)物組相比，羊瘙癢因子263K和139A感染的倉(cāng)鼠腦組織中CK2α和CK2β含量均明顯降低，同時(shí)出現(xiàn)明顯的CK2α′。對(duì)139A感染的C578L小鼠腦組織檢測(cè)顯示，除了CK2α和CK2β含量降低，出現(xiàn)CK2α′以外，還出現(xiàn)另一種類(lèi)型的CK2α——CK2α″。這些結(jié)果證明在羊瘙癢病終末期動(dòng)物腦組織中，CK2含量明顯降低并且出現(xiàn)新的CK2α亞基類(lèi)型。新出現(xiàn)的CK2α亞基的類(lèi)型與感染

3、動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)，而與接種的羊瘙癢病的毒株種類(lèi)無(wú)關(guān)。為了進(jìn)一步了解CK2含量及亞基類(lèi)型變化的確為T(mén)SE共有的特征，特別是在人類(lèi)TSE，我們對(duì)一例家族型克雅氏病(Familial Creutzfeldt-Jakob disease，fCJD)和一例家族型致死性失眠癥(FFI)腦組織中CK2a進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與羊瘙癢因子實(shí)驗(yàn)感染的小鼠一樣，CK2α和CK2β含量顯著減少，出現(xiàn)了CK2α′和CK2α″，CK2α亞基類(lèi)型與小鼠相似。而fCJD和

4、FFI病人腦組織中CK2α亞基類(lèi)型無(wú)明顯差異。 為了進(jìn)一步研究CK2在TSE發(fā)病中的作用，提取人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y總RNA，利用RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出人CK2α和CK2β全長(zhǎng)cDNA序列，并亞克隆至原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)并通過(guò)Ni-NTA Agarose獲得了純化的CK2α和CK2β蛋白。用CK2特異性抗體對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示所獲得的重組蛋白均可被特異性抗體識(shí)別，在相應(yīng)的分子量處呈現(xiàn)出明顯的反應(yīng)條

5、帶。 分別利用PrP和CK2特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，證明全長(zhǎng)的重組CK2α能與全長(zhǎng)的重組人PrP蛋白能夠在體外形成分子間相互作用，而CK2β則不能與PrP蛋白發(fā)生結(jié)合。為了進(jìn)一步了解腦組織中天然狀態(tài)的CK2α能否與天然狀態(tài)的prp<'C>蛋白作用，分別利用Pull-down試驗(yàn)和免疫共沉淀試驗(yàn)證明了腦組織中內(nèi)源性CK2α和PrP能夠作用并結(jié)合，三種不同糖基化形式的PrP均能與CK2α結(jié)合，其中無(wú)糖基化形式的PrP顯示出較強(qiáng)的C

6、K2α結(jié)合能力。為了確定PrP與CK2α的相互作用位點(diǎn)，表達(dá)并純化了PrP N-端區(qū)(PrP23-90)和PrP C-端區(qū)(PrP90-231)蛋白，利用免疫共沉淀方法證明CK2α與PrP的結(jié)合部位位于C-端(PrP90-231)多肽。 這些結(jié)果首次提出了在可傳播性海綿狀腦病發(fā)病終末期CK2含量和亞基類(lèi)型的變化，提示CK2可能參與TSE的發(fā)?。粡姆肿铀缴鲜状翁峁┝巳酥亟M和天然CK2和PrP蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為深入探討CK