紅景天苷改善血管內(nèi)皮功能及其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用與分子機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述:
　　第一部分 紅景天苷改善內(nèi)皮功能及其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制
　　目的：紅景天苷是天然植物紅景天(Rhodiola Rosea)的主要有效成分。已有研究提示紅景天苷具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但其具體機(jī)制不明確。血管內(nèi)皮功能紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要特征為內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）功能障礙。本課題

2、擬研究紅景天苷能否通過(guò)激活eNOS，改善內(nèi)皮功能從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,并對(duì)eNOS上游相關(guān)的信號(hào)分子-AMP依賴(lài)的蛋白激酶(Adenosine5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK）和磷脂酰肌醇-3激酶/蘇氨酸激酶（Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K/Akt）在其激活中的作用進(jìn)行探討。
　　方法：（1）ApoE-/-小鼠適應(yīng)

3、性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為正常飲食組（normal diet，ND）和高脂飲食（high fat diet，HFD）組，喂養(yǎng)8周，隨后將高脂飲食組隨機(jī)分為高脂飲食組，紅景天苷25mg/kg組和紅景天苷50mg/kg組。紅景天苷通過(guò)灌胃給藥8周，正常飲食和高脂飲食組用生理鹽水灌胃作為對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12小時(shí)，分離血清，檢測(cè)生化指標(biāo)；采用油紅O染色觀察整體主動(dòng)脈及主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積；采用離體血管灌流方法，檢測(cè)小鼠血管舒張功能；采用蛋白印跡（

4、Western Blot）方法檢測(cè)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈中eNOS，AMPK和Akt的表達(dá)及磷酸化，同時(shí)檢測(cè)apoE-/-小鼠肝臟中AMPK磷酸化及表達(dá)。（2）大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能檢測(cè)：取Wistar大鼠胸主動(dòng)脈，離體血管灌流方法檢測(cè)血管舒張功能。（3）在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中，Western Blot法檢測(cè)紅景天苷對(duì)eNOS，AMPK和Akt的

5、磷酸化及表達(dá)的影響；用AMPK抑制劑（Compound C），AMPKα1/2 siRNA和PI3K抑制劑（LY294002）處理細(xì)胞，Werstern Blot法檢測(cè)紅景天苷對(duì)AMPK, Akt及eNOS激活的因果關(guān)系；高效液相色譜法檢測(cè)紅景天苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP及AMP水平的影響；采用特異的熒光探針3-氨基-4-氨甲基-2’,7’-雙熒光素雙乙酸酯（3-Amino,4-aminomethyl-2',7'-difluorescein di

6、acetate, DAF-FM-DA）、5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯咪唑基羰花基碘化物（5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-5, tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanine iodid, JC-1）和二氫溴乙菲啶（dihydroethidium, DHE）分別檢測(cè)一氧化氮（nitric oxide, NO），線粒體膜電位（mitochondrial

7、membrane potential，Δψm）和超氧陰離子（superoxide anion, O2.-）水平的變化。
　　結(jié)果：（1）與高脂飲食組相比，紅景天苷治療組（50 mg/kg）主動(dòng)脈根部和整體主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積顯著減少，小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)性顯著增加；與高脂飲食相比，紅景天苷治療組小鼠胸主動(dòng)脈中eNOS ser1177位點(diǎn)磷酸化和表達(dá)水平顯著增加, eNOS上游激酶AMPK和Akt磷酸化水平也顯著增加；與高脂飲

8、食相比，紅景天苷治療組血清總膽固醇（total cholesterol，TC），低密度膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）水平顯著降低，同時(shí)肝臟中AMPK thr172位點(diǎn)磷酸化和表達(dá)水平顯著增加。（2）紅景天苷對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈具有直接舒張作用，eNOS抑制劑 L-NG-硝基精氨酸甲酯（NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME）和物理性去除內(nèi)皮可

9、以抑制紅景天苷對(duì)血管的舒張作用。（3）在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，紅景天苷顯著增加細(xì)胞eNOS ser1177位點(diǎn)的磷酸化水平，降低eNOS thr495位點(diǎn)的磷酸化水平，促進(jìn)eNOS的表達(dá)。同時(shí)，DAF-FM-DA的熒光值也顯著增加，這些作用均具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性，說(shuō)明紅景天苷可以激活eNOS，促進(jìn)NO釋放。紅景天苷促進(jìn)eNOS上游激酶AMPK thr172位點(diǎn)的磷酸化，這種作用從5分鐘開(kāi)始，30分鐘達(dá)到峰值，超過(guò)6小時(shí)后消失。而其對(duì)eNOS另一個(gè)

10、上游激酶Akt ser473位點(diǎn)的磷酸化的促進(jìn)作用從30分鐘開(kāi)始，持續(xù)至24小時(shí)。AMPK抑制劑Compound C和AMPK siRNA可以抑制紅景天苷作用30分鐘時(shí)對(duì)eNOS和Akt的磷酸化水平的增加作用，說(shuō)明此時(shí)紅景天苷對(duì)eNOS和Akt的激活作用依賴(lài)于AMPK。PI3K抑制劑LY294002抑制紅景天苷作用24小時(shí)時(shí)對(duì)eNOS磷酸化和表達(dá)水平的增加作用。紅景天苷適度降低線粒體膜電位，減少細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，增加細(xì)胞內(nèi)AMP/AT

11、P的比率。
　　結(jié)論：紅景天苷減輕HFD誘導(dǎo)的apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，這與紅景天苷調(diào)節(jié)血脂和激活eNOS，改善內(nèi)皮功能有關(guān)。紅景天苷通過(guò)輕度降低線粒體膜電位，增加AMP/ATP比率，激活A(yù)MPK/Akt/eNOS/NO信號(hào)通路而發(fā)揮改善內(nèi)皮的作用。
　　第二部分 紅景天苷抗H2O2所致血管內(nèi)皮功能紊亂的作用及機(jī)制
　　目的:活性氧（reactive oxygen species,ROS）增加損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)

12、致血管血管內(nèi)皮功能紊亂。作為ROS的主要來(lái)源，大量的研究證實(shí)線粒體功能紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮了重要的作用。本部分?jǐn)M研究紅景天苷是否對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）所致的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能紊亂具有保護(hù)作用，并從線粒體生物合成，線粒體功能和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等方面來(lái)探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法：以過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）作為損傷因素，建立HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，基于酶聯(lián)免

13、疫吸附測(cè)定法(ELISA)的方法分析紅景天苷對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的影響；血管灌流法檢測(cè)大鼠血管舒張功能；Western Blot方法檢測(cè)eNOS，AMPK及Akt磷酸化及表達(dá)和線粒體生物合成相關(guān)蛋白PGC-1α和TFAM的表達(dá)；線粒體熒光探針Mito Tracker green檢測(cè)紅景天苷對(duì)線粒生物合成的影響；采用特異的熒光探針 DAF-FM-DA, JC-1和DHE分別檢測(cè)NO，Δψm和O2.-水平的改變；高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

14、ATP水平。
　　結(jié)果：紅景天苷（≤10μM）對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著影響，紅景天苷預(yù)孵育可減輕H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；紅景天苷改善H2O2引起的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能紊亂，抑制H2O2引起的超氧陰離子和NO的釋放。紅景天苷抑制H2O2引起的eNOS，AMPK和Akt的激活；紅景天苷抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性，同時(shí)抑制0.1μM H2O2引起的NF-κB的激活，H2O2100μM抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，紅景天

15、苷預(yù)孵育可以使其進(jìn)一步降低；紅景天苷刺激線粒體生物合成，上調(diào)線粒體生物合成相關(guān)因子PGC-1α和TFAM的表達(dá)，eNOS抑制劑L-NAME可以抑制這種作用；紅景天苷預(yù)孵育減輕H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低和ATP生成減少，改善H2O2誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂。
　　結(jié)論：紅景天苷預(yù)處理可激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路，促進(jìn)NO產(chǎn)生。這種作用一方面上調(diào)PGC-1α和TFAM表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物合成，改善線粒體功能，從而抵抗H2O2誘導(dǎo)的線