AT4R過表達(dá)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是一類非常重要的心血管疾病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊形成可導(dǎo)致管腔狹窄引發(fā)缺血，而斑塊破裂及血栓形成則可導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生。因此，對于AS早期斑塊形成和晚期斑塊穩(wěn)定性的研究一直是國內(nèi)外冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病研究的熱點(diǎn)問題。
　　腎素—血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在心血管系統(tǒng)疾病的病理生理中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。血管緊張素Ⅳ型受體(AT4R)是RAS系統(tǒng)中的一員，是一種Ⅱ型膜蛋

2、白并且屬于鋅金屬肽酶M1家族。同時(shí)AT4R被認(rèn)為是一種胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶（IRAP）并可以通過結(jié)合血管緊張素Ⅳ(AngⅣ)發(fā)揮作用。在心內(nèi)膜、心外膜、血管平滑肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等心血管的組織和細(xì)胞中都有AT4R的存在。既往研究發(fā)現(xiàn)AT4R可以誘導(dǎo)激活肺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性并且參與調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈的舒張。AT4R還可協(xié)同成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)參與血管重建。此外，研究還發(fā)現(xiàn)AT4R和

3、AngⅣ共同作用可以改善AngⅡ刺激以及缺血再灌注引起的心功能紊亂和損傷。在晚期AS模型中，AngⅣ通過結(jié)合AT4R能夠改善內(nèi)皮功能，增加eNOS活性及降低超氧化物的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮血管保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AngⅣ可通過結(jié)合AT4R，在心血管系統(tǒng)疾病中起著保護(hù)作用，然而AT4R其本身在AS中發(fā)揮何種作用及其可能的作用機(jī)制尚未見報(bào)道，這為我們提供了課題思路和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方向。
　　目的：
　　1.探討AT4R過表達(dá)對AS早期斑

4、塊形成的影響;
　　2.探討AT4R過表達(dá)對AS晚期斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　3.闡明AT4R過表達(dá)抗AS作用可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建ApoE-/-小鼠AS動(dòng)物模型
　　(1)早期組:8周齡雄性ApoE-/-小鼠普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后給予高脂飲食（0.25％的膽固醇和15％的黃油）8周。高脂飲食至第4周將小鼠隨機(jī)分為Ad-AT4R組，Ad-EGFP組和Control組，每組20只。Ad-AT4

5、R組和Ad-EGFP組分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體，病毒滴度為2×109 PFU，體積為200μL。Control組同時(shí)注射等量的PBS溶液。2周后重復(fù)注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第8周處死小鼠。
　　(2)晚期組:8周齡雄性ApoE-/-小鼠全程高脂飲食14周。高脂飲食至第2周行右頸總動(dòng)脈套管植入術(shù)，套管長度為2mm，內(nèi)徑為0.3mm,外徑為0.5mm。第10周行頸動(dòng)脈超聲檢查斑塊形成情況并將小鼠隨機(jī)分為三組

6、:Ad-AT4R組，Ad-EGFP組和Control組，每組20只，分別通過尾靜脈注射攜帶有AT4R的腺病毒、空病毒載體及等量的PBS溶液。病毒滴度為2×109 PFU，體積為200μL。2周后重復(fù)注射一次。繼續(xù)高脂飲食至第14周處死小鼠。
　　2.體重及血糖、血脂的檢測
　　小鼠處死前禁食，稱量體重并于左心室穿刺取血，收集血清，檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(L

7、DL-C)、血糖(GLU)。
　　3.早期斑塊面積的檢測
　　取早期組小鼠的主動(dòng)脈根部包埋成石蠟標(biāo)本并常規(guī)5μm切片，HE染色。另取主動(dòng)脈根部沖洗，OCT包埋，常規(guī)5μm冰凍切片，油紅O染色，同時(shí)行主動(dòng)脈大體油紅O染色。使用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算陽性染色面積占相應(yīng)主動(dòng)脈管腔的面積百分比。
　　4.晚期斑塊的檢測
　　(1)易損指數(shù):OCT包埋晚期組小鼠的右頸總動(dòng)脈，常規(guī)5μm冰凍切片并行油紅O

8、染色、HE染色及天狼猩紅染色。免疫組化檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞（MOMA-2）以及平滑肌細(xì)胞(SMC)的含量。使用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算陽性染色面積占AS斑塊而積的百分比。易損指數(shù)根據(jù)以下公式計(jì)算:易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞百分含量+脂質(zhì)百分含量）/（平滑肌細(xì)胞百分含量+膠原百分含量）。
　　(2)免疫組化:采用免疫組化的方法檢測斑塊內(nèi)促炎性因子IL-6、TNF-a及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)。使用Imag

9、e-Pro Plus6.0軟件計(jì)算陽性染色面積占AS斑塊面積的百分比。
　　(3) Western Blot:提取晚期組小鼠右頸總動(dòng)脈的組織蛋白，并用Western Blot的方法檢測促炎性因子IL-6、TNF-a，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9以及RAS系統(tǒng)其他組分比如AT1R、AT2R、MasR、ACE、ACE2的蛋白表達(dá)水平。使用ImageJ軟件分析蛋白表達(dá)含量。
　　(4)明膠酶譜:提取晚期組小鼠右頸總動(dòng)脈的組

10、織蛋白，采用明膠酶譜的方法檢測MMP-2及MMP-9的活性。使用Image J軟件分析。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間差異采用單因素的方差分析(ANOVA)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.早期組
　　1.1 AT4R過表達(dá)對ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響
　　Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Contr

11、ol組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、血脂指標(biāo)(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　1.2 AT4R轉(zhuǎn)染效率的測定
　　小鼠肝臟和主動(dòng)脈根部斑塊可見明顯顆粒狀黃綠色熒光，提示病毒成功轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi);Western Blot檢測Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈組織蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AT4R表達(dá)量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P＜0.05)，說明AT4R成功過表達(dá)。
　　1

12、.3 AT4R過表達(dá)對AS早期斑塊的形成的影響
　　與Ad-EGFP組及Control組對比，Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積百分比明顯降低(P＜0.05)，而Ad-EGFP與Control組之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.晚期組
　　2.1 AT4R過表達(dá)對ApoE-/-小鼠體重及血糖血脂的影響
　　Ad-AT4R組、Ad-EGFP組和Control組三組之間小鼠的體重及血糖(GLU)、

13、血脂指標(biāo)(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.2 AT4R轉(zhuǎn)染效率的測定
　　小鼠右頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)可見明顯顆粒狀黃綠色熒光，提示病毒成功轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi);Western Blot檢測Ad-AT4R組小鼠主動(dòng)脈組織蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AT4R表達(dá)量明顯高于Ad-EGFP組和Control組(P＜0.05)，說明AT4R成功過表達(dá)。
　　2.3 AT4R過表達(dá)對AS晚期斑塊的穩(wěn)定性的影響

14、
　　與Ad-EGFP組和Control組對比，Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及脂質(zhì)百分含量降低(P＜0.05)，平滑肌細(xì)胞和膠原含量增加(P＜0.05)，斑塊易損指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，而Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.4 AT4R過表達(dá)對晚期斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a的表達(dá)水平的影響
　　與Ad-EGFP組及Control組對比，Ad-AT4R

15、組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，Ad-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.5 AT4R過表達(dá)對晚期斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)和活性的影響
　　與Ad-EGFP組及Control組對比，Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，且MMP-2和MMP-9的活性降低(P＜0.05)，A

16、d-EGFP組與Control組之間未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.6 AT4R過表達(dá)對晚期斑塊內(nèi)RAS其他組分的影響與Ad-EGFP組及Control組對比，Ad-AT4R組小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)RAS其它組分(AT1R，AT2R，MasR，ACE and ACE2)蛋白表達(dá)未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.AT4R過表達(dá)可通過降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊的形成;
　　2.