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文檔簡介
1、目的:
近年來,肥胖與糖尿病的發(fā)病率有增無減。前脂肪細胞分化與2型糖尿病、肥胖、胰島素抵抗和心血管疾病的產生與發(fā)展有著密切聯(lián)系,所以研究前脂肪細胞的分化是國內外的研究熱點。中醫(yī)藥對脂肪細胞分化的具有一定的影響和療效,這對于2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖和心血管疾病的防治及減輕其危害具有重要意義。近些年來有研究顯示和厚樸酚對2型糖尿病以及肥胖有可觀的療效,但具體的作用機制尚未明確。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome
2、proliferatoractivativedreceptors,PPAR是核受體超家族成員,大量研究表明,PPARs與肥胖、糖尿病、心血管疾病以及腫瘤有密切關系,并成為防治上述疾病的重要靶標。PPAR有α、γ、δ三種亞型,他們的功能和分布各異。PPARγ主要分布在脂肪、脾、腎和結腸中,在脂肪合成與分解過程中起著關鍵的作用。特異性PPARγ配體已經在臨床中廣泛應用,療效顯著,但其可能的副作用也是主要難題。尋找有效和副作用少PPARγ配體
3、是目前研究的熱點。3T3-L1前脂肪細胞(Swiss小鼠胚胎成纖維細胞)是體外研究脂肪細胞與脂質代謝的理想細胞模型。和厚樸酚(Honokiol),是中藥厚樸主要活性成分,具有行氣化濕、溫中止痛、降逆平喘之用。最早發(fā)現其具有抗自由基和脂質過氧化的作用,隨后又有研究發(fā)現其有抗炎、抗腫瘤、抗菌、調理腸胃、抗糖尿病、保護心血管等藥理作用。近年來其在糖尿病方面的藥理活性越來越受重視,因此有必要深入探究和厚樸酚的作用機制,為治療糖尿病發(fā)現新的靶標。
4、文獻顯示,許多酚類化合物具有PPARs激活作用,但和厚樸酚是否具有直接結合PPARγ并激活PPARγ信號通路調控脂肪細胞分化尚無相關報導。
因此,本課題提出和厚樸酚可能通過靶向結合PPARγ調控3T3-L1前脂肪細胞分化。為了驗證這一假說,首先證實了和厚樸酚通過PI3K/Akt信號通路調控胰島素信號通路誘導3T3-L1前脂肪細胞分化成脂肪細胞。然后抑制PPARγ受體后檢測和厚樸酚誘導分化作用是否減弱。為進一步開發(fā)和研制以PPA
5、Rγ為靶標的中醫(yī)藥提供理論依據。
方法:
1.和厚樸酚對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響
培養(yǎng)3T3-L1脂肪前體細胞,采用經典的“雞尾酒”法誘導3T3-L1前脂肪細胞分化作為陽性對照組。分組為:對照組、和厚樸酚組、“雞尾酒”組、“雞尾酒”+和厚樸酚組。給予不同濃度的和厚樸酚進行干預,用MTT法檢測和厚樸酚對細胞活性的影響,選取合適的濃度進行下面的實驗。采用油紅染色檢測3T3-L1前脂肪細胞第8天分化程度;
6、同時檢測不同組間的甘油三酯水平;采用RT-PCR以及法檢測各組3T3-L1前脂肪細胞的相關基因表達差異。
2.和厚樸酚通過調節(jié)PPARγ促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化
實驗結果表明和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化,用雙熒光素酶報告基因法檢測和厚樸酚對PPAR反應元件及PPARγ啟動子活性的影響,采用PPARγ拮抗劑GW9662抑制PPARγ的活性,同時給予和厚樸酚干預,檢測細胞內的甘
7、油三酯含量,油紅0染色檢測3T3-L1前脂肪細胞的脂質積聚,并測量各組間的OD值,采用RT-PCR以及QRT-PCR法檢測脂肪細胞脂肪標志性蛋白aP2以及轉錄因子PPARγ、CEBP/α等mRNA的表達,Western Blot檢測PPARγ,Glut4,P-Akt的蛋白表達水平。
結果:
1.MTT結果顯示濃度在1-15μM和厚樸酚對細胞活性沒有影響,25μM以上濃度的和厚樸酚抑制細胞活性。和厚樸酚顯著增加前脂肪細
8、胞分化過程中脂質的堆積,促進脂肪細胞標志性蛋白aP2和轉錄因子PPARγ和C/EBPα、Acrp30與G1ut4等mRNA水平,同時和厚樸酚增加PPARγ、P-Akt、Glut4蛋白的表達,其機制與促進PPARγ和C/EBPα mRNA與蛋白質表達有關。
2.雙熒光素酶報告基因結果顯示和厚樸酚上調PPRE及PPARγ啟動子的活性。PPARγ拮抗劑GW9662作用3T3-L1前脂肪細胞后,和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟
9、脂肪細胞分化的作用明顯減弱。同時脂肪細胞標志性蛋白aP2和轉錄因子PPARγ和C/EBPαmRNA水平也明顯減弱。
結論:
1.和厚樸酚誘導3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化,并促進細胞內葡萄糖轉運,增加脂肪形成相關基因如PPARγ、Acrp30、C/EBPα、aP2的表達。
2.GW9662抑制PPARγ后,和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞分化的作用明顯減弱,可能因為GW9662與和厚樸酚競爭性結合P
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