結(jié)晶紫降解菌株的分離鑒定、降解特性及降解機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)晶紫是一種人工合成的三苯甲烷類染料，常用于紡織、印染、油墨工業(yè)、環(huán)保、礦業(yè)、鋼鐵、醫(yī)藥和日用化學(xué)品的分析。結(jié)晶紫含有復(fù)雜芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因而化學(xué)穩(wěn)定性高、生物可解性低，因而在廢水中能夠積累導(dǎo)致嚴(yán)重的地表水和地下水污染。環(huán)境毒理學(xué)表明，結(jié)晶紫具有中毒、致癌、致畸和致突變等毒副作用。由結(jié)晶紫造成的水源污染和水產(chǎn)品的安全問題已引起了廣泛重視并急需解決。生物降解是清除環(huán)境污染的有效途徑之一，具有高效、安全、成本低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此篩選高效降

2、解結(jié)晶紫的微生物資源，探索其降解的作用機(jī)理，充分發(fā)揮其降解能力，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本課題研究的目標(biāo)是分離出能夠高效降解結(jié)晶紫的降解菌株，并對(duì)該菌株在各種環(huán)境條件下降解結(jié)晶紫的特性進(jìn)行研究，同時(shí)探索菌株降解結(jié)晶紫的機(jī)制，以期為結(jié)晶紫染料廢水的處理工作提供科學(xué)依據(jù)。
　　從長(zhǎng)期受染料污染的污泥中分離出一株能夠?qū)Y(jié)晶紫降解脫色的菌株SJ-1。根據(jù)形態(tài)、生理生化和16S rRNA基因序列分析，將菌株SJ-1歸屬到鞘氨醇單胞菌屬

3、（Sphingomonas sp.）。本文探索了降解菌株SJ-1的最適生長(zhǎng)條件，菌株SJ-1生長(zhǎng)最適溫度為30℃，最適生長(zhǎng)初始pH為7.0。隨著通氣量的增加，菌株的生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。在供試的幾種碳氮源中，對(duì)蛋白胨和酵母粉的利用為最好。在LB培養(yǎng)基中，SJ-1的生長(zhǎng)曲線，0-6 h為延滯期，6-24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h后為穩(wěn)定期。
　　對(duì)降解菌株降解特性的研究表明，使用LB培養(yǎng)基，菌株SJ-1在3 d可使200 mg/L結(jié)晶紫幾

4、乎完全脫色。該菌株降解結(jié)晶紫的適宜溫度為25～30℃，適宜pH值為6.0～8.0；通氣量對(duì)SJ-1影響較小，在缺氧條件下也可較好地降解結(jié)晶紫，4 h時(shí)通氣量較小試驗(yàn)組（裝液量≥125 mL）降解率仍大于40％。
　　在對(duì)SJ-1結(jié)晶紫降解酶的酶學(xué)特性的研究中，建立了酶學(xué)反應(yīng)體系：總體積5 mL，PBS4.85 mL（0.1 mol/L，pH=7.0），結(jié)晶紫50μL（終質(zhì)量濃度200 mg/L），酶液100μL。反應(yīng)10 min后

5、冰浴終止，用丙酮提取結(jié)晶紫殘留，根據(jù)結(jié)晶紫減少量確定酶活。本文中，一個(gè)酶活單位是指1 min內(nèi)去除1μmol結(jié)晶紫所需的酶量。實(shí)驗(yàn)表明：該結(jié)晶紫降解酶在60℃以下酶活損失較慢，pH6.0-8.0時(shí)能保持較高的酶活；甲醇和異戊醇對(duì)該酶活性影響較小，而二氯甲烷和丙酮對(duì)該酶活性影響較大。Zn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Co2+等10種金屬離子中，F(xiàn)e2+對(duì)結(jié)晶紫降解有促進(jìn)作用，其他金屬離子對(duì)結(jié)晶紫降解酶都有不同程度的抑制作用。酶的誘導(dǎo)

6、和定域?qū)嶒?yàn)表明,SJ-1的結(jié)晶紫降解酶位于細(xì)胞外，屬組成型表達(dá)酶。
　　根據(jù)已報(bào)道的三苯甲烷還原酶基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法從降解菌SJ-1中克隆到了三苯甲烷還原酶，其堿基數(shù)為864 bp，編碼288個(gè)氨基酸序列。通過SJ-1中tmr2基因序列與GeneBank中同源序列的比較發(fā)現(xiàn)，在基因水平上，八株降解菌的三苯甲烷還原酶基因有18個(gè)點(diǎn)堿基有差異；相互之間的同源性為98%～100%；在氨基酸水平上，八株降解菌的三苯甲烷還原酶