水稻葉片蠟質(zhì)基因OsHSD1的克隆與功能分析.pdf

1、通過本研究，可以得到以下總結(jié):
　　1.從自然突變?nèi)后w中獲得了穩(wěn)定遺傳的蠟質(zhì)缺陷突變體。和野生型比較，突變體的株高變矮，葉片容易沾水下垂，結(jié)實(shí)率正常。遺傳分析發(fā)現(xiàn)該突變體受一個(gè)隱性單基因控制。后續(xù)的圖位克隆證實(shí)是OsHSD1的突變體，故將其命名為Oshsd1。用掃描電鏡觀察該突變體葉片發(fā)現(xiàn)，其表皮片狀蠟質(zhì)變得稀疏，但沒有變得光滑，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體Oshsd1葉片強(qiáng)嗜鋨性的區(qū)域明顯增厚，表皮層增厚。進(jìn)一步的GC-MS蠟質(zhì)組分

2、分析發(fā)現(xiàn)突變體Oshsd1葉片中除了C30的伯醇急劇下降外，其他幾乎所有的組分都出現(xiàn)了積累，導(dǎo)致突變體葉片總蠟質(zhì)含量比野生型增加了37％。根據(jù)突變體Oshsd1所表現(xiàn)出的這些不同以往蠟質(zhì)突變體的特征，初步判定Oshsd1是一個(gè)新的葉片蠟質(zhì)缺陷突變體。
　　2.通過對突變體Oshsd1蠟質(zhì)組分的測定發(fā)現(xiàn)，突變體葉片各蠟質(zhì)組分都出現(xiàn)增加，特別是所有的脂肪酸都出現(xiàn)了累積，包括C16、C18脂肪酸以及C26、C28、C30特長鏈脂肪酸都出

3、現(xiàn)顯著的增加。對葉片總的可溶性脂肪酸含量的測定結(jié)果顯示，葉片中所測定的脂肪酸在突變體Oshsd1中都增加了。尤其明顯的是，C16和C18飽和脂肪酸以及C18∶3不飽和脂肪酸相對于野生型分別增加了32％、54％和37％。但對種子中的脂肪酸卻沒有影響。依據(jù)這些結(jié)果可以推測OsHSD1參與了維持葉片中的脂肪酸穩(wěn)態(tài)。
　　3.利用“突變體“Oshsd×岳晚秈”配制的F2定位群體將OsHSD1定位在第11號染色體上標(biāo)記M8和M9之間，兩者的

4、物理距離為16.9 kb。該區(qū)間只有兩個(gè)ORFs，其中ORF1(LOC_Os11g30560)注釋為羥基類固醇脫氫酶（OsHSD1），ORF2為表達(dá)蛋白。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)ORF1在其第5個(gè)外顯子上發(fā)生了突變，其中一個(gè)C突變成G以及另外3個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致苯丙氨基酸變成亮氨酸以及酪氨酸的丟失。而ORF2在野生型和突變體Oshsd1之間沒有差異。為了進(jìn)一步證實(shí)ORF1是候選基因，我們將野生型的ORF1導(dǎo)入到突變體Oshsd1中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植

5、株葉片表皮蠟質(zhì)恢復(fù)正常，GC-MS測定的各蠟質(zhì)組分也都恢復(fù)到與野生型一樣的水平。因此，OsHSD1的突變是導(dǎo)致突變體出現(xiàn)蠟質(zhì)缺陷的原因。
　　4.利用qPCR對OsHSD1在各組織的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)OsHSD1在葉、葉鞘、莖、根、成熟穗中均有表達(dá)，在葉鞘中表達(dá)最高，其他組織表達(dá)相對較低。與qPCR結(jié)果一致，GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株組織染色也表明，GUS在葉片、葉鞘、莖、根、穎殼和花藥均有表達(dá)，進(jìn)一步GUS組織切片顯示GUS信號主

6、要發(fā)生在它們的維管組織。同時(shí)，OsHSD1表達(dá)受溫度、鹽脅迫、BL和干旱因素影響。
　　5.通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)OsHSD1同源蛋白主要是一些油體相關(guān)蛋白，為了探索OsHSD1的亞細(xì)胞定位，我們用擬南芥中已知定位在油體上的AtHSD1作為marker，在原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，OsHSD1發(fā)現(xiàn)能與AtHSD1重合。用油體熒光染料尼羅紅作為油體marker，在水稻、擬南芥原生質(zhì)體以及酵母表達(dá)OsHSD1的信號都能與尼羅紅重合，證實(shí)了O

7、sHSD1定位在油體上。這也是水稻中第一個(gè)證實(shí)了定位在油體上的蛋白。同時(shí)我們通過水稻和擬南芥的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)還證明了OsHSD1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。由此可以認(rèn)為OsHSD1是一個(gè)雙定位蛋白，既定位在油體上又定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　6.酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在以β-雌二醇或腎上腺酮作為底物，NAD+/NADP+為輔酶的情況下，OsHSD1能夠催化β-雌二醇或腎上腺酮，產(chǎn)生NADH或NADPH，而且顯示出以NAD+作為輔酶的偏好，從而表現(xiàn)出羥基類

8、固醇脫氫酶的活性。因此，OsHSD1是一個(gè)依賴于NAD+/NADP+羥基類固醇脫氫酶，可能以β-雌二醇或腎上腺酮類似物為內(nèi)源性底物。
　　7.通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)OsHSD1突變位點(diǎn)緊鄰YxxxK酶活位點(diǎn)，對OsHSD1及突變之后蛋白OsHSD1Δ的酶活活性比較發(fā)現(xiàn)，在以NAD+/NADP+為輔酶，β-雌二醇或腎上腺酮為底物的情況下，OsHSD1和OsHSD1Δ都表現(xiàn)出相似的酶活，表明該突變并不顯著影響OsHSD1的酶活。但是通過